胰島移植緩解糖尿病大鼠腎臟纖維化的實驗研究

徐自強 金昊 王瑾珺

糖尿病腎病是引起終末期腎病的第一大疾病［1］。大量動物實驗和臨床研究表明，持續高血糖引起的代謝改變可影響糖尿病腎病的發生和發展。因此，維持穩定理想的血糖是早期治療糖尿病腎病的關鍵［2］。近年來，隨著胰島分離純化技術的逐漸成熟和完善，胰島移植已成為治療糖尿病并發癥的重要方法之一。國內多中心已常規開展胰島移植術來治療糖尿病患者。研究發現，胰島移植后可以明顯改善糖尿病患者腎臟疾病，尿微量白蛋白和血肌酐水平均明顯降低。然而，移植物排斥反應仍是影響胰島細胞長期存活的重要因素。海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）微囊是一種生物相容性較好的半透膜，可以阻止胰島細胞與受者免疫系統接觸，還能讓體積小的營養物質自由進入，具有免疫隔離作用［3］。本研究通過移植APA微囊化的胰島細胞至糖尿病大鼠腹腔內，并觀察其對腎臟保護作用以及探討可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗大鼠由溫州醫科大學動物中心提供，16只8周健康雄性SD大鼠和12只8周健康雄性Wistar大鼠，體重約200～220 g。海藻酸鈉由上海精細化工科技有限公司提供；聚左賴氨酸、Ⅴ型膠原酶、鏈脲佐菌素為美國Sigma公司產品；雙硫腙（DTZ）為上海三愛思試劑有限公司產品；Ficoll-Paque PLUS溶液為美國GE公司產品；RPMI 1640、D-Hank's液為吉諾生物醫藥技術有限公司產品；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自上海朗頓生物科技有限公司；兔源單克隆抗體轉化生長因子-β1（TGF-β1）和兔源單克隆抗體結締組織生長因子（CTGF）購自Bioworld公司。

1.2 胰島細胞分離和微囊化 異氟烷吸入麻醉成功后，Wistar大鼠腹部V形切口，破心處死。在左右肝管分叉處行膽總管插管；然后向胰管內灌注8～10 mL（濃度0.8 mg/mL，pH 7.8）V型膠原酶溶液。待胰腺膨脹后，整塊獲取，立即放入相同濃度Ⅴ型膠原酶溶液離心管中；38℃恒溫水浴消化約15 min，等待大部分胰腺組織成乳糜狀后，加入35 mL 4℃ Hank's 液終止消化；棄上清液，再次加入25 mL 4℃ Hank's液振搖50 s，過800 μm不銹鋼篩網，將沉淀轉移至15 mL 離心管中，加入RPMI 1640液至15 mL，離心洗滌5 min。在消化后的胰腺組織中加入5 mL Ficoll-Paque PLUS 溶液，充分混勻，加入Hank's 液5 mL，離心15 min，吸取Hank's液和Ficoll-Paque PLUS 液交界層液面的組織懸塊，即為純化的胰島，洗滌，采用RPMI1640培養液，37℃、5% CO2培養，準備制備胰島微囊。FDA-PI染色計算胰島活性：將胰島細胞團同PI、FDA各7 μL混勻，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光染色情況，估算存活的細胞在所有細胞中所占比例，并計數約50個胰島細胞團的活性比例，最終計算出平均值作為胰島活性大小。胰島當量（IEQ）計算：依據LEMBERT等［4］制定的方法，鏡下計數DTZ陽性細胞團，用標尺測其直徑，用IEQ表換算為直徑相當于150 μm胰島的IEQ，然后根據以下公式算得總胰島當量：總胰島當量（IEO）=3次胰島總當量÷3×20×樣本量（mL）。將4000當量胰島與15 g/L海藻酸鈉溶液5 mL混合。采用高壓靜電成囊技術將上述混合液逐步滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中，從而形成海藻酸鈣微膠珠，再投入0.5%聚左賴氨酸溶液中反復振搖；然后用1.5 g/L海藻酸鈉溶液包裹；最后以55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液液化囊心，生理鹽水洗滌，即得包裹胰島的APA微囊。

1.3 APA微囊化大鼠胰島及未包囊胰島糖刺激實驗 將500當量微囊化和未微囊化胰島置于12孔培養板中，于37 ℃、5% CO2培養箱培養過夜。去培養液后，胰島細胞首先在37 ℃低葡萄糖（2.22 mmol/L）培養液中培養2 h，取上清液于4℃保存；然后再更換37℃高葡萄糖（22.2 mmol/L）培養液中培養2 h，取上清液。用ELISA 試劑盒測定兩種濃度培養后上清液的胰島素濃度，按以下公式計算刺激指數（SI）：SI=高糖環境下胰島素的分泌濃度／低糖環境下胰島素的分泌濃度。

1.4 實驗分組和收集標本 SD大鼠按50 mg/kg劑量給予鏈脲佐菌素（溶劑為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.2），腹腔一次性注射。術后每日予以正常飲食。在72 h后連續3次測大鼠血糖均維持在＞16.6 mmol/L，認為糖尿病大鼠建模成功。實驗分三組。糖尿病腎病組（n=6）；微囊移植組（n=4），糖尿病建模后8周，腹腔內移植1200當量的APA微囊化胰島，術后非禁食下血糖持續≤16.6 mmol/L，可作為胰島功能存活判定標準；正常對照組（n=6）。實驗分組后4周，收集各組24 h尿液，行24 h尿蛋白定量。麻醉后處死大鼠，收集腎臟和腎動脈標本，并且觀察微囊在腹腔中的狀態。在0°鹽水環境下收集雙腎。雙刀法組織修塊，快速分離出3～5小塊腎皮質（大小約1×1×1 mm3），立即浸泡于2.5%戊二醛電鏡保存液中固定，置于4℃冰箱備電鏡檢測，剩余的腎組織和腎動脈標本放入預冷的4%多聚甲醛中，4～6 h固定，備檢免疫組化。

1.5 電鏡標本制作與觀察 在冰鹽水環境下橫斷皮質髓質，迅速取大小約1×1×1 mm3腎皮質組織塊于2.5%戊二醛前固定＞2 h，漂洗，1%鋨酸后固定1 h，漂洗3次，塊染（1%醋酸鈾2 h），梯度脫水，浸透（100%丙酮：包埋劑 1∶1，37℃烘箱2 h，丙酮：包埋液1∶4，37℃烘箱過夜；純包埋液45℃烘箱2 h），包埋聚合（環氧樹脂45℃烘箱3 h），半薄切片定位腎小球，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立H7500透射電鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學 石蠟切片（3μm）脫蠟水化，微波修復，采用SP法免疫組化試劑盒檢測腎臟組織CTGF和TGF-β1表達，采用相同方法檢測腎動脈MCP-1表達。所有操作按照說明書進行。陽性結果為胞膜或胞漿內棕黃色線狀或顆粒物顯色。采用單盲法，各組大鼠每張切片隨機選取10個視野（×400）拍照，應用Imagepro plus圖像分析軟件進行半定量分析，測定陽性部位的平均光密度（MD）。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 葡萄糖刺激胰島分泌實驗 未微囊化胰島和微囊化胰島在低糖下的胰島分泌濃度分別為（0.25±0.03）ng/mL和（0.25±0.03）ng/mL，兩組差異無統計學意義（P＞0.05），高糖刺激下胰島素釋放量為（0.63±0.07）ng/mL和（0.60±0.06）ng/mL，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。高糖刺激下胰島素釋放量為低糖刺激的＞2倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組SI分別為（2.54±0.36）和（2.43±0.47），差異無統計學（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠生化指標檢測 移植前，糖尿病腎病組和微囊移植組大鼠血糖均明顯升高（28.57±1.58 mmol/LVS.30.35±0.90 mmol/L，P＞0.05），兩組間比較無明顯統計學差異；糖尿病腎病組和微囊移植組大鼠24小時尿蛋白均顯著高于正常組（P＜0.05），但兩組比較差異無統計學意義（51.26±4.69 mgVS.52.45±2.58 mg，P＞0.05）。手術術后，微囊移植組血糖逐步下降，至2周左右下降至最低，但仍高于正常。術后3周，微囊移植組血糖開始逐步升高。術后28 d，微囊移植組血糖和糖尿病腎病組血糖比較差異有統計學意義（20.35±1.40 mmol/LVS.31.62±1.51 mmol/L，P＜0.05）。24 h 尿蛋白定量微囊移植組比糖尿病腎病組明顯下降（25.58±4.68 mgVS.51.26±4.69 mg，P＜0.001）。微囊移植組與正常組24 h尿蛋白比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 直視及電鏡改變 實驗結束時，打開移植組大鼠腹腔，觀察到APA微囊成簇聚集，表面可見纖維樣組織包裹，局部還可見新生血管，大部分黏附于大網膜、腸系膜及腹壁上（見圖1）。在電鏡下，糖尿病腎病組腎小球濾過膜上的足細胞形態改變，表現為局部足突增寬、相互融合，且基底膜節段增厚；而微囊移植組腎小球足細胞足突排列整齊，基底膜結構清晰，不規則增厚少見，形態接近于正常組腎小球濾過膜結構（見圖2）。

圖1 腹腔內包含胰島素的APA微囊聚集成簇（黑色箭頭）

圖2 各組腎臟電鏡檢查

2.4 免疫組化結果 TGF-β1在腎內主要表達部位為腎小球。糖尿病腎病組和微囊移植組TGF-β1表達較正常對照組升高。微囊移植組TGF-β1在腎小球的表達較糖尿病腎病組降低（0.12±0.02VS.0.26±0.04，P＜0.05）。CTGF主要表達部位為腎小管間質，在正常組中幾乎不表達，但在其他兩組腎小管間質中明顯表達。糖尿病腎病組CTGF在腎間質中表達較微囊移植組明顯升高（0.35±0.04VS.0.14±0.03，P＜0.05）。MCP-1主要在血管平滑肌細胞中表達。在糖尿病組中，大鼠腎動脈平滑肌層中MCP-1表達明顯升高，但其在微囊移植組中的表達明顯降低（0.34±0.05VS.0.25±0.04，P＜0.05）。見圖3～5。

圖3 各組TGF-β1免疫組化

圖4 各組CTGF免疫組化

圖5 各組腎動脈MCP-1表達

3 討論

糖尿病腎病典型的病理表現與代謝相關的腎小球硬化癥［5］。持續的高血糖狀態引起的代謝改變是影響糖尿病腎病發生發展的關鍵。因此，良好的血糖控制是糖尿病腎病治療的關鍵。胰島移植短期內恢復受者血糖的效果非常理想［6］。此外，大量臨床研究發現胰島移植可以逆轉早期糖尿病腎病，恢復正常的腎小球濾過功能［7-8］。然而胰島移植遠期效果并不理想，大部分患者常需要二次移植。主要原因包括移植物慢性排斥反應，免疫藥物毒副作用和局部炎癥反應［9-11］。因此，目前大部分研究者專注于通過改進胰島純化技術，增加單次移植的胰島數量；改進免疫抑制方案，減少藥物對胰島損害；或采用新的生物材料包裹胰島細胞，起到保護隔絕作用，從而延長移植物的存活。

本實驗中，采用APA微囊包裹胰島，腹腔移植改善糖尿病大鼠持續高血糖狀態。APA微囊是一種生物相容性良好的半透膜。其孔徑允許氧氣、糖等營養成分自由進出，同時可以阻止胰島細胞直接與受者的免疫細胞直接接觸［12］。因此，微囊化胰島細胞團體內移植后，可以在不使用免疫抑制劑的情況下維持胰島分泌功能。實驗結果表明，移植后糖尿病腎病大鼠腎小球濾過屏障結構得到顯著改善。在實驗后期，隨著微囊內胰島分泌功能下降，移植組大鼠血糖逐步上升，但至結束時微囊組大鼠血糖仍低于糖尿病組。相比于前期胰島移植實驗，微囊化的胰島移植對體內血糖調控效果略差。主要因機體的抗異物反應，導致微囊被纖維組織包裹，引起囊內胰島細胞缺氧死亡，而體內局部炎癥反應，加重這一過程［13］。因此，較多研究者希望利用新的相容性更好的人工生物材料來包裹胰島細胞團，減少體內反應，延長存活時間。研究發現，微囊表面結合間充質干細胞，可以促進血管新生，達到延長微囊內胰島細胞團存活時間［14］。

TGF-β1是重要的調節因子，其能引起腎臟組織一系列顯微結構改變，包括系膜增厚和細胞外基質合成增加，誘導足細胞凋亡；此外，TGF-β1使內皮細胞向間質樣細胞轉變，最終導致腎小球硬化，且促進腎小管和間質纖維化［15］。CTGF是TGF-β1下游介質之一，能介導細胞間相互粘附，并促進炎癥細胞遷移浸潤及誘導細胞外基質合成［16］。TGF-β1表達增加可以促進平滑肌細胞、系膜細胞、血管內皮細胞和腎小管上皮細胞中CTGF表達上調。持續高血糖狀態可以促進TGF-β1過度表達，激活TGF-β1/Smad途徑，上調下游促纖維介質活化，導致腎小球硬化和腎間質纖維化過程［17］。在整個實驗過程中，糖尿病腎病大鼠血糖明顯好轉，雖不能完全恢復正常，但大鼠腎組織纖維化程度仍明顯緩解。隨著大鼠血糖好轉，腎臟組織中TGF-β1及下游的CTGF蛋白的表達均明顯下降。作者推測胰島細胞團可以根據血糖波動持續分泌胰島素，糾正體內高血糖狀態，并且可以維持穩定的血糖狀態，這可能更有利于早期糖尿病腎病的恢復。還有文獻報道，胰島分泌的C肽對于糖尿病腎病也有治療作用，但具體機制尚不明確［18］。MCP-1是評估血管硬化的重要指標。持續高血糖可通過多種途徑引起腎臟損害，不僅直接導致腎小球硬化癥，還會造成腎內各級動脈硬化、閉塞，減少腎內血流，加重腎臟纖維化。實驗顯示，糾正持續高血糖可以顯著改善糖尿病大鼠腎動脈硬化程度。因此，推測腎臟內動脈的硬化程度也得到一定的改善，從而抑制腎小球的纖維化。

綜上所述，采用腹腔APA微囊化胰島移植，可以顯著減少早期糖尿病腎病大鼠的尿蛋白總量。其可能機制是通過抑制TGF-β1及下游CTGF表達，以及改善腎臟血管硬化程度，最終達到緩解腎臟纖維化過程。目前微囊化的胰島移植長期治療效果仍不理想，但隨著生物工程進步，微囊化胰島移植技術將為臨床治療糖尿病腎病提供一個新的策略。