血清巨噬細胞極化相關因子與多房棘球蚴病肝纖維化的相關性分析

鄂維建， 蘆永良， 祁秉民， 龐明泉， 王志鑫， 張靈強， 樊海寧

青海大學附屬醫院 a.檢驗科， b.肝膽胰外科， 西寧 810001

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)是我國最危險的寄生蟲病之一，潛伏期較長，且早期通常無明顯癥狀[1-2]。多房棘球蚴的肝內定植和持續增殖通常會引起嚴重的肝臟肉芽腫性炎癥反應，形成“免疫抑制”微環境，導致免疫細胞(包括巨噬細胞)在病灶周圍大量浸潤[3]，其中增加的巨噬細胞迅速浸潤肉芽腫，數量遠超過T淋巴細胞，這說明巨噬細胞是肝AE組織浸潤的主要細胞群之一。然而，由于巨噬細胞具有明顯的異質性和功能多樣性，其在AE發病中的作用尚未完全闡明[4]。本研究旨在討論巨噬細胞極化(促炎性M1巨噬細胞和抗炎性M2巨噬細胞)與AE肝纖維化的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年9月—2020年10月期間，在本院肝膽胰外科住院治療的AE患者120例(男49例，女71例，年齡為18～77歲，中位年齡40歲)作為AE組。符合世界衛生組織AE非正式工作小組2003年版分型標準[5]和中國醫師協會外科醫師分會包蟲病外科專業委員會2015年版專家共識[6]，根據常規腹部磁共振成像(MRI)-DWI檢查診斷為AE，接受部分肝切除術，收集活檢組織標本。術前未接受任何相關治療如抗寄生蟲化療、保肝藥物、經皮肝穿刺膽道外引流術等。術前Child-Pugh肝功能分級為A～B級。排除標準：(1)急性和慢性病毒感染和自身免疫性疾病；(2)風濕性疾病和惡性腫瘤；(3)與棘球蚴病感染沒有直接關系的感染性疾病，包括嚴重呼吸道感染、肝膽管感染、敗血癥和高熱；(4)長期使用抗炎藥物，包括激素類、非甾體抗炎藥和阿片類藥物。另外從醫院血庫捐獻者中選取33例健康對照者(年齡、性別相匹配)，其中男20例，女13例，平均年齡45.42(20～73)歲。血常規檢查、心電圖和B超檢查均無明顯異常。

1.2 實驗方法

1.2.1 資料收集 所有患者均記錄了身高、體質量、職業、民族及是否有肝性腦病的基本資料。通過腹部超聲檢查評估肝臟腫塊的位置、數量、橫徑、縱徑及腹水情況。另外，根據Knodell的組織學活動指數(Histologicalactivity index，HAI)進行炎癥評分。

1.2.2 獲取血液樣本和組織樣本 (1)血液樣本：對照組受試者于入組后靜坐20 min后、觀察組患者于手術治療前1 h分別采集外周靜脈血置于離心管中，4 ℃環境下3000 r/min離心25 min，留取血清待測。(2)組織樣本：將觀察組患者切除肝臟標本分為距病灶中心≤2 cm的肝組織及距病灶中心>2 cm的正常肝組織，兩組肝臟樣本均用10%甲醛固定，經石蠟包埋后制成3 μm切片，用于蘇木精-伊紅染色(HE)和Masson三色染色分析。

1.2.3 HE染色及肝纖維化分級 將切片置于60 ℃的烘箱中2 h烤片后，依次用二甲苯I、II脫蠟，梯度乙醇溶液水化。滴加蘇木素染液5 min后，1%鹽酸酒精分化5～10 s。伊紅染液二次染色3 min，再依次從低濃度至高濃度順序用乙醇溶液脫水。最后用二甲苯透明后干燥封片。由同一組經驗豐富的病理科醫生對組織切片進行Metavir纖維化分期：F0表示無肝纖維化；F1表示門靜脈區域纖維化；F2表示肝纖維化并不局限于門靜脈區域，還包括肝小葉部分；F3表示肝小葉中央靜脈纖維化；F4表示假小葉形成，甚至發展成肝硬化(圖1、2)。

注：a，距病灶中心>2 cm的正常肝組織；b，距病灶中心≤2 cm的肝組織。

注：a，距病灶中心>2 cm的正常肝組織；b，距病灶中心≤2 cm的肝組織。

1.2.4 血清巨噬細胞相關因子檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ，試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 倫理學審查 研究方案得到了本院倫理委員會的批準，所有研究對象均提供了書面的知情同意書。

2 結果

2.1 2組基線資料比較 AE組和正常對照組性別及年齡差異均有統計學意義(P值均<0.05)；2組人群其他指標比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 AE組和正常對照組人群基線資料

2.2 2組人群血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1水平比較 AE組IL-6、TNFα、TGFβ1水平均顯著高于正常對照組(P值均<0.05)(表2)。

表2 2組人群血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1水平分析

2.3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者肝纖維化的關系 利用Masson染色法觀察膠原沉積區域。結果顯示，距病灶中心>2 cm的正常肝組織肝門區無炎性細胞浸潤，膠原纖維較少或無。而距病灶中心≤2 cm的肝組織肝小葉正常結構消失，肝細胞排列紊亂，體積增大，核溶解，藍藻纖維組織明顯增生和沉積。比較不同肝纖維化程度肝AE患者的血清學指標，隨著肝纖維化程度的加重，IL-6、TNFα水平明顯升高，其中肝纖維化F4級患者的IL-6、TNFα水平最高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；肝AE患者的TGFβ1水平也隨著肝纖維化程度加重而升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，但F4級患者的TGFβ1水平有低于F3級的趨勢。經Spearman分析，血清IL-6(r=0.530，P<0.001)、TNFα(r=0.758，P<0.001)、TGFβ1(r=0.567，P<0.001)水平與Metavir纖維化評分均呈正相關性，而血清IL-10(r=-0.288，P=0.001)與Metavir纖維化評分則呈負相關性(表3、圖3)。

2.4 單因素及多因素logistic回歸分析血清巨噬細胞相關因子與AE肝纖維化的關系 經單因素和多因素logistic回歸分析，血清IL-6、TNFα水平升高是肝AE患者發生肝纖維化的獨立危險因素(P值均<0.05)(表4)。

2.5 ROC曲線分析血清學檢查對肝AE患者發生肝纖維化的診斷價值 經ROC曲線分析，血清學檢查聯合IL-6、TNFα對于肝纖維化的診斷敏感度和特異度分別為88.4%和95.8%，AUC為0.951(95%CI：0.937～0.964)，均高于IL-6、TNFα、包蟲抗體IgG單獨診斷(Z值分別為-3.458、-4.011、2.379，P值均<0.05)(表5)。

2.6 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者HAI評分的關系 經Spearman分析，血清IL-6(r=0.560，P<0.001)、TNFα(r=0.644，P<0.001)、TGFβ(r=0.465，P<0.001)水平與HAI評分均呈正相關性，而血清IL-10(r=-0.232，P=0.011)與HAI評分則呈負相關性(圖4)。

表3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者肝纖維化的關系分析

圖3 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者Metavir纖維化評分的關系分析

表4 單因素和多因素logistic回歸分析肝AE患者發生肝纖維化的相關因素

表5 AE組患者血清IL-6、TNFα水平聯合診斷肝纖維化的臨床價值

圖4 血清IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1與肝AE患者HAI評分的關系分析

3 討論

肝臟是多房棘球絳蟲感染的主要靶器官，肝AE雖為良性疾病，但形態上與肝癌相似，并能通過局部侵襲、轉移擴散至肺、腦、腎等器官[7]。免疫應答在AE疾病的發生、發展中起著重要作用，有研究表明蟲體對宿主機體的免疫系統有影響，其可通過調節固有免疫及獲得性免疫來逃逸宿主的免疫追擊，創造蟲體長期寄生的條件[8]。因此本研究對屬固有免疫的巨噬細胞極化相關因子與AE疾病的相關性進行研究。

巨噬細胞作為具有異質性、可塑性的免疫細胞，可以極化成M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。損傷的肝組織中肝細胞索排列紊亂、細胞間間隙擴張還伴隨著炎性細胞浸潤，若肝損傷持續未愈會導致肝纖維化，目前已有很多研究發現巨噬細胞極化參與著肝纖維化的發生、發展過程[9-10]。例如劉新等[11]對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化模型的肝纖維化進程中M1及M2型巨噬細胞表型改變情況進行分析，證實隨著小鼠肝小葉結構破壞、肝纖維化生成，M2/M1型巨噬細胞表達比值在進展中呈先減小后逐漸增大的趨勢，其中M1型巨噬細胞標志物CD11c mRNA先升高后降低，而M2型巨噬細胞標志物CD206、Arg-1 mRNA則在下降后逐漸升高。因此作者推斷在肝纖維化過程中，巨噬細胞極化是由M1型主導逐漸演變為M2型主導的過程。而如CD11c等此類M1型巨噬細胞標志物可表示M1型巨噬細胞活化狀態，相同的CD206等M2型巨噬細胞標志物也提示著M2型巨噬細胞的活性。M1型巨噬細胞可以分泌促炎細胞因子(如IL-6、IL-12、TNFα、IL-18等)[12]、釋放趨化因子招募其他免疫細胞、誘導Th1反應發生，使肝組織持續處于炎癥階段、促纖維化生成；而M2型巨噬細胞被發現與寄生蟲、蠕蟲、真菌感染關系密切，其可分泌抑炎因子(如IL-10、TGFβ1等)，招募中性粒細胞、單核細胞、T淋巴細胞以調節炎癥反應，具有抑制炎癥反應及纖維化作用，加速肝損傷后的肝組織修復[13]。

此外，有研究[14-16]發現在器官組織纖維化進展中，巨噬細胞極化與TGFβ1/Smad調節起著重要作用，如Smad3和Smad4阻斷TGFβ1的信號傳導有利于抑制巨噬細胞極化，進而抑制相關疾病進展。例如槲皮素能夠抑制肝纖維化肝組織中巨噬細胞M1型極化及M1型巨噬細胞相關的炎性細胞因子IL- 1β、IL-6水平，從而減輕四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化進展[17]。此外由寄生蟲引起的肝纖維化與巨噬細胞極化也密切相關，如陳聰等[18]證實血吸蟲感染肝臟細胞后，Kupffer細胞以及血吸蟲蟲卵產生的可溶性抗原會激活CD4+T淋巴細胞，使其募集大量巨噬細胞和炎性細胞至病灶，促使肉芽腫和肝纖維化進展，而M1巨噬細胞和M2巨噬細胞的形成及相互轉換與肝纖維化密切相關。因此本研究結果也證實AE組的IL-6、TNFα、TGFβ1水平顯著高于正常對照組，且血清IL-6、TNFα水平升高是肝AE患者發生肝纖維化的獨立危險因素，同時經ROC曲線分析，血清學檢查聯合IL-6、TNFα對于肝纖維化的診斷敏感度和特異度良好。因此檢測IL-6、TNFα水平對于診斷肝纖維化可提供一定的參考信息。此外，隨著肝纖維化程度的加重，AE患者血清IL-6、TNFα水平明顯升高，其中肝纖維化F4級升高最明顯。說明血清巨噬細胞極化相關因子與肝纖維化的發生和進展都有一定關聯，但是其因果關系尚不能明確。

綜上，肝AE患者普遍存在巨噬細胞極化狀態，且巨噬細胞極化相關因子IL-6、TNFα、TGFβ1水平與肝纖維化的發生和進展有關，對于預測肝纖維化的發生可提供一定的參考信息。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：鄂維建負責課題設計，資料分析，撰寫論文；王志鑫、祁秉民、龐明泉、張靈強、樊海寧參與收集數據，修改論文；鄂維建、蘆永良擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。