外泌體在肝纖維化發生發展及診治中的作用

羅業浩， 陳秋霞， 呂 挺， 區佩琪， 曹知勇， 段雪琳

1 廣西中醫藥大學， 壯醫方藥基礎與應用研究重點實驗室， 南寧 530200；2 湖北民族大學 醫學部， 湖北 恩施 445000

肝纖維化是由酒精性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝病引起的慢性肝損傷反應[1]。在促肝纖維化的過程中，會導致肝臟細胞外基質(extracellular matrix, ECM)成分的過度沉積以及纖維生成和纖維溶解之間的不平衡，從而破壞了肝臟的結構，導致肝細胞損傷和肝臟功能失調，最終導致肝衰竭[2]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化、轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGFβ)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)或金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMP)的平衡失調被證實在肝纖維化的發生過程中發揮重要作用。在肝纖維化形成過程中，多種細胞產生的外泌體相互影響、相互作用，共同調控細胞因子及細胞群的一系列變化[3]。本文總結了外泌體的功能及其對肝纖維化的作用機制，并且為外泌體對肝纖維化的發生發展及診斷與治療提供依據。

1 外泌體的典型特征

外泌體是細胞分泌的3種胞外囊泡之一，是通過細胞胞吐作用釋放的一種膜性泡體，經過細胞內吞早期核內體后，早期核內體經囊膜內陷、突入轉變為胞內多泡體，胞內多泡體一方面與溶酶體融合降解，另一方面與質膜融合后將小囊泡釋放到細胞外空間，最終形成外泌體[4](圖1)。初期研究發現，外泌體主要調節廢棄蛋白質和其他微細分子的排出，后來發現其可參與抗原遞呈和適應性免疫反應，對于治療疾病提供了新方法。外泌體廣泛存在于人體的血液、唾液、尿液、腹水和腦脊液，包含了蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，如mRNA、miRNA等[5]。外泌體的功能取決于其來源的細胞類型。一般來說，外泌體可以參與免疫反應、細胞遷移、細胞分化和腫瘤侵襲等過程。外泌體內特定的組分使得其在細胞通訊中起著重要的作用，有助于調控細胞因子及細胞群的一系列變化，如抑制巨噬細胞活化和細胞因子分泌的能力，ECM的重塑及誘導HSC的失活，進而逆轉肝纖維化的進展。外泌體調節肝纖維化進程主要是以其作為細胞間信號傳遞的載體來實現的[6]。

注：外泌體的形成首先經過細胞內吞產生早期核內體，經過膜結合信號蛋白及胞漿蛋白使囊膜內陷，再突入變成胞內多泡體，胞內多泡體與溶酶體及質膜融合，最后將小囊泡排出細胞外形成外泌體。

2 外泌體在肝纖維化中的作用及其機制

2.1 外泌體參與細胞因子分泌介導肝纖維化進程 外泌體內含的TGFβ 是調節細胞生長和分化的因子，從最初的肝損傷到炎癥和纖維化全程參與。肝損傷誘導的活性TGFβ水平刺激許多生長因子和細胞因子表達水平的增加，如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、IL-1α、IL-β、IL-22、IL-6和TNFα，這些生長因子和細胞因子促進肝纖維化形成[7]。

活性TGFβ水平的增加會提高肝細胞破壞水平，并介導HSC和成纖維細胞的活化，產生肌成纖維細胞和ECM的沉積[8]。研究[9]發現來源于人臍帶間充質干細胞的外泌體通過減少Ⅰ/Ⅲ型膠原和TGFβ以及SMAD2蛋白的磷酸化可以顯著恢復血清AST活性并使TGFβ1信號通路失活，從而抑制肝細胞上皮-間充質轉化和Ⅰ/Ⅲ型膠原產生來改善肝纖維化。

CTGF是TGFβ的下游效應介質，能夠誘導成纖維細胞增殖、分化，是肝纖維化中另一種重要的促纖維化刺激因子[10]。最近發現，活化的HSC衍生的外泌體含有CTGF，并且CTGF的含量隨著肝纖維化進程加劇而不斷提高。HSC釋放富含外泌體的Twist1和miR214/199-5a簇，也可降低激活的HSC中CTGF表達[11]。

2.2 外泌體參與巨噬細胞趨化活化進而促進肝纖維化 巨噬細胞是一種異質的細胞群，根據激活狀態和功能不同，巨噬細胞可以分為經典激活的巨噬細胞M1和交替激活的巨噬細胞M2。巨噬細胞在炎癥及肝纖維化的形成中，具有雙向作用[12]。巨噬細胞活化后能釋放大量炎癥介質，促使HSC向肌成纖維細胞分化，促進纖維化進程。巨噬細胞產生特定的MMP，其降解基底膜并允許炎癥細胞和募集的成纖維細胞進入損傷部位。它們分泌TGFβ1、PDGF和許多趨化因子等多種促纖維化介質[13]。M1、M2a和M2c 等各種類型的巨噬細胞在纖維化過程中被募集，導致再上皮化、愈合或病理性瘢痕形成。

然而，巨噬細胞在纖維化的消退中也發揮著獨特的作用。巨噬細胞可以激活參與修復的干細胞和細胞群，這些巨噬細胞分泌IL-10和TGFβ等多種抗炎介質，在抑制免疫系統和緩解炎癥中起主要作用[14]。如M2巨噬細胞抗原遞呈能力較弱，通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGFβ和甘露糖受體來下調免疫反應，從而在免疫調節中發揮重要作用。巨噬細胞還可以誘導肌成纖維細胞凋亡，清除細胞碎片，并刺激肌成纖維細胞中MMP的產生。有實驗[15]表明，巨噬細胞缺失的轉基因大鼠可減少肝纖維化的形成和肌成纖維細胞的減少。因此，不同表型的巨噬細胞在組織修復的不同階段發揮獨特而關鍵的作用。

2.3 外泌體參與ECM重塑從而介導肝纖維化 肝纖維化的關鍵環節是肌成纖維細胞的激活，打破肝臟中ECM的合成與降解平衡。肌成纖維細胞的激活可促進ECM的重塑作用[16]。由于慢性損傷，肌成纖維細胞增殖及分化受到異常ECM引起的細胞外應激反應。由于膠原蛋白過度表達和降解減少導致ECM的過度積累，是肝纖維化的關鍵特征。活化的肌成纖維細胞分泌ECM，形成應激纖維誘導的細胞-基質連接，進一步促進ECM重塑。而且，膠原產生水平的降低、TIMP-1表達的減少以及肝膠原酶和彈性蛋白酶活性的增加導致ECM降解和重塑[17]。

人體分泌的外泌體中包含多種細胞分子，它們能夠在胞外體與ECM的成分相互作用，使多種膠原蛋白裂解，進而重塑ECM[18]。而一種已被證明在ECM中降解硫酸的乙酰肝素，同樣在胞外體表達，并參與炎癥反應[19]。因此，外泌體蛋白質充分參與了炎癥和ECM重塑的調節。

2.4 HSC活化是肝纖維化的中心環節 HSC是主要的纖維化細胞，位于肝細胞和竇內皮細胞之間的竇周間隙，是驅動纖維化過程的活化肌成纖維細胞和門靜脈成纖維細胞的主要來源。在正常肝臟中，HSC保持非增殖、靜止的表型，肝損傷或體外培養后，HSC被激活，從儲存維生素A的細胞向肌成纖維細胞轉化，可導致ECM水平升高[20]。使用遺傳模型追蹤分析表明，活化的HSC是肝損傷中ECM的主要來源，也是肝臟膠原的主要來源，可以大量分泌ECM蛋白、TIMP和MMP，HSC在纖維化肝臟中占總纖維Ⅰ型膠原的80%[21]。

在纖維化開始時，靜止的HSC可分化為活化的HSC，并且導致α平滑肌肌動蛋白、結蛋白和Ⅰ型膠原的含量顯著上調，膠原的持續積聚改變了肝實質和血管結構，導致肝功能受損、疤痕沉積和肝纖維化的形成。細胞壞死的炎癥反應誘導常駐型免疫細胞逐漸釋放PDGF、TGFβ、TNFα和其他炎癥因子[22]。在正常肝臟中，層粘連蛋白、Ⅳ型膠原和蛋白多糖的混合物分散在肝臟ECM中[23]。肝纖維化形成所需的Ⅰ型和Ⅲ型膠原在纖維化肝臟中含量豐富。HSC表達整合素和含盤狀結構域的受體(discoidin domain receptor, DDR)這兩種類型的膠原受體，每種類型都接收來自ECM成分的信號，以調節細胞黏附、分化、增殖和遷移。整合素可以控制TGFβ的釋放和激活，因此是抑制其激活的潛在細胞表面靶點。在急性肝損傷中，HSC還通過DDR2與膠原相互作用，進一步加劇纖維化進程。這些信號導致HSC的激活和增殖，并誘導HSC分化為肌成纖維細胞，驅動ECM的合成，最終導致肝纖維化[24]。

總結外泌體對肝纖維化的影響機制見圖2。

注：富含PDGF、CCN2、TGFβ、CTGF等因子的外泌體促進HSC活化，進一步導致肌成纖維細胞的形成；HSC釋放富含外泌體的Twist1和miR214/199-5a簇，以及炎癥因子TNFα、IL-1α、IL-β、IL-22和IL-6以使HSC失活；富含MT1-MMP、乙酰肝素酶、整合素、DDR和LOXL2的外泌體參與ECM重塑；富含PDGF、TRAIL、TGFβ1、CD40L等促纖維化介質促進巨噬細胞的活化；外泌體所含的抑制性因子TGFβ、IL-10、甘露糖受體參與巨噬細胞滅活從而誘導肌成纖維細胞凋亡。

3 外泌體在肝纖維化診斷和治療中的價值

3.1 外泌體在肝纖維化診斷中的應用 肝活檢是評估、診斷肝纖維化公認的金標準，但具有疼痛、出血、感染甚至死亡的潛在風險。肝活檢的質量還會受到樣本大小、取樣誤差、纖維化中期表現水平降低等影響[25]。因此，需要一種侵入性較小、可重復且準確的方法來評估慢性肝病患者的纖維化水平。纖維化嚴重程度的評估為晚期肝纖維化、肝硬化與肝衰竭提供了預后價值，對制訂治療方案至關重要[26]。

纖維化嚴重程度可通過間接標志物和直接標志物進行評估。直接標志物包括Ⅲ型膠原的氨基末端前肽(the amino-terminal propeptide of type Ⅲ procollagen, PⅢNP)、透明質酸和TIMP-1。PⅢNP、透明質酸在肝臟ECM中非常普遍。TIMP-1是ECM合成和降解的關鍵調節劑，其水平隨著肝纖維化的嚴重程度而不斷增加[27]。Mac-2結合蛋白是一種參與ECM黏附的新標志物，在許多慢性肝病中作為纖維化的替代物顯示出滿意的結果[28]。Zhao等[29]發現，在肝纖維化患者血清中，活化的HSC釋放的外泌體miR-122水平較健康人高。通過熒光定量PCR檢測血清miR-122水平可反映肝臟損傷程度。所以，血清miR-122也可作為肝纖維化診斷的潛在血清學標志物。

3.2 外泌體在肝纖維化治療中的應用 肝纖維化是對慢性肝損傷的傷口愈合反應，其特征是肝內ECM及瘢痕組織的過度積聚。另外，肝纖維化的形成與多種細胞因子以及多種信號傳導途徑有關。如果不能很好地控制肝纖維化，則可能惡變為肝硬化，從而進展為肝衰竭或肝癌，然而肝纖維化在原則上是可以逆轉的[30]。

基于活化的HSC在肝纖維化過程中的重要作用，通過激活的HSC由激活表型逆轉為靜息表型，或加速活化的HSC凋亡來抑制HSC的激活是解決肝纖維化的有效方法[31]。受損肝細胞產生的活性氧向HSC內含的熱休克蛋白提供旁分泌激活信號。NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOX)是一種跨膜酶復合物，在一系列刺激下產生活性氧，NOX1或NOX4的缺失可減輕小鼠模型的肝損傷、炎癥反應和肝纖維化[32]。乙醇脫氫酶3(alcohol dehydrogenase 3, ADH3)可通過增強HSC活化和抑制自然殺傷細胞活性，在促進肝纖維化方面發揮重要作用。而抑制ADH3可促進IFNγ的產生和自然殺傷細胞對HSC的滅活，從而導致膠原酶和TGFβ表達下調。ADH3還可通過防止HSC中視黃醇的代謝，來大量提高凋亡HSC的數量和增強自然殺傷細胞活化水平，進而改善模型大鼠的肝纖維化[33]。

研究[34]表明，膠原酶活性的增加、活化的肌成纖維細胞的消失、促炎和纖維化細胞因子的抑制導致ECM產生的減少和降解的增加，最終導致肝纖維化的逆轉。外泌體生物學的新興領域已經確定了幾種新的外泌體細胞間的轉移途徑，這些途徑不僅促進肝纖維化的發展，同樣可以幫助緩解纖維化。例如，來自人體的外泌體可以運輸生物活性抗纖維化分子，包括蛋白質和核酸，這些分子反過來可調節靶細胞中的基因表達和細胞功能[35]。一項報告[36]指出，人羊膜上皮細胞衍生的外泌體在肝纖維化過程中顯著減少巨噬細胞和巨噬細胞浸潤的數量。

外泌體分泌的CTGF與整合素、低密度脂蛋白受體相關蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖共受體相互作用，刺激HSC的黏附、遷移、增殖和分化[37]。在激活的HSC的外泌體向靜止的HSC轉移中，CTGF通過調節Twist-miR-214/199軸直接導致HSC的活化[38]。靜止的HSC可產生抑制HSC活化和減弱纖維生成途徑的外泌體，從而導致miR-214、miR-199a-5p或Twist-1向受體HSC的外泌體轉移，并直接抑制CTGF的轉錄，抑制下游膠原蛋白的產生，使HSC恢復到靜止的表型[39]。

由于骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMSC)的免疫調節特性，BMSC的移植被認為是治療各種肝臟疾病和免疫障礙的潛在治療手段。BMSC可分泌肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子等幾種抗纖維化分子[40]。雖然確切的治療機制尚不清楚，但已經有研究表明BMSC通過抑制纖維化肝臟中的輔助性T淋巴細胞17的激活來減輕肝纖維化。BMSC釋放的外泌體可抑制人肝星狀細胞系和大鼠的原代HSC的增殖與活化[41]。除了來源于BMSC的外泌體，從血清中分離的外泌體也顯示出對肝纖維化小鼠具有治療作用。用小鼠血清的外泌體可減少酸損傷或硫代乙酸損傷小鼠的肝纖維化生成，實驗[42]結果表明，小鼠表現出肝功能改善、肝細胞凋亡減少、肝損傷炎癥反應抑制、肝臟促炎細胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFNγ和TNFα)釋放的減少、炎癥浸潤的減少和ALT水平降低。“健康的外泌體”幫助受損肝臟修復的主要機制可能是旁分泌因子的釋放。這些外泌體穿梭于細胞間隙，在不同的肝細胞之間傳遞“治療分子”，導致膠原酶活性升高，使激活的肌成纖維細胞消失，促炎和纖維化細胞因子減少，最終導致ECM產生減少和肝纖維化消退[43]。

外泌體的成分不受蛋白酶降解影響的特征，使其可在血清中精準的檢測到，成為許多臨床應用的理想生物標志物[44]。實驗[45]發現，甘氨酸N-甲基轉移酶敲除的小鼠模型的尿液外泌體中，CD10蛋白水平的增加與纖維化和肝細胞癌有關。F3、F4級肝纖維化患者的血清外泌體中檢測到miRNAs (miR-34c、miR-151-3p、miR-483-5p、miR-532-5p)水平的降低，也表明miRNA對于檢測肝纖維化提供實質性依據。miR-30a在TGFβ1誘導的HSC外泌體中顯著下調，miR-30a通過直接靶向其30-UTR區域來抑制其下游效應因子Beclin1，直接抑制Beclin1介導的自噬來防止肝纖維化[46]。

據報道，巨噬細胞可以釋放含有病原體相關分子模式的外泌體，導致原始受體免疫細胞的激活。這些巨噬細胞的外泌體可以被主動地內吞到胎盤組織中并驅動細胞因子的釋放[47]。因此，巨噬細胞-免疫細胞外泌體途徑代表了免疫細胞間抗原轉移的新的非細胞相關機制。巨噬細胞衍生的外泌體被鄰近的免疫細胞攝取后，可導致免疫調節和炎癥反應的改變。巨噬細胞同樣可在纖維化消退的機制中表現出重要的作用[48]。

4 小結與展望

外泌體正在成為多種疾病的有效治療工具，它們的小尺寸允許其跨越細胞無法跨越的生物屏障，并可作為強大的藥物和基因治療的轉運體，從而提高了“無細胞治療”的開發前景。本文詳細闡述了肝纖維化的逆轉機制，主要表現為促炎和纖維化細胞因子的減少、ECM產生的重塑和纖維瘢痕的減少，以及肌成纖維細胞群的失活和消失。由于外泌體作為細胞間轉移的導管，并已被證明其足以抑制動物模型中的肝纖維化，因此外泌體作為人類肝纖維化的治療手段具有廣闊的應用前景。

然而，外泌體治療肝纖維化等肝臟疾病仍有許多可繼續探討的問題。例如，外泌體的定性和定量應該如何標準化？目前提取方法與技術尚不成熟，需要更有效的方法和技術來大規模生產外泌體；用于治療的外泌體的合適來源尚未清楚，可在后續分析細胞來源的外泌體或循環外泌體中的可視化信息，為外泌體的治療提供獨特的識別“分子信號”。應如何評價外泌體的給藥？外泌體調節的信號通路是依賴外泌體劑量多少來實現的，外泌體劑量的調節可直接導致外泌體治療效果的優劣，因此可以在后續研究中對劑量的把控進行更深層次的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：羅業浩負責課題設計、資料分析及撰寫論文；陳秋霞、呂挺參與收集數據及修改論文；區佩琪、曹知勇、段雪琳負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。