銀腺楊PagAG2 基因的時空表達分析

鐘姍辰，武舒，王黎，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091)

楊屬（PopulusL.）植物分布廣泛，不僅具有較高的經濟和生態價值，同時也是木本模式植物，在林木分子生物學研究等方面具有重要作用。然而，作為北方城市重要的道路綠化和城市景觀樹種，楊樹在提高城市綠化水平的同時，也因其花粉在每年春季大量飄散而引起了一定的植源性污染問題。楊樹雄株散落的花粉以空氣為傳播媒介，通過人體呼吸及皮膚接觸造成呼吸道疾病和皮膚過敏等問題，危害著人體健康[1-3]。除更換樹種外，目前關于花粉污染的應對策略主要還包括人工噴水增濕、增強地表對花粉的吸附能力等。另外，日益發展的生物技術推動了林木遺傳育種進程，有望成為解決花粉等植源性污染的有效途徑之一。目前關于楊樹的研究主要聚焦于其材性及抗逆性等方面，而對楊樹的生殖發育研究相對較少。

楊樹童期較長且雌雄異株，不同于大多數由萼片、花瓣、心皮（雌蕊/雄蕊）、胚珠4 輪結構組成的被子植物花，楊樹的雌花和雄花均高度簡化，其中，雄花著生于苞片腋間，由退化的盤狀花被和雄蕊構成，花藥為黃色或紅色，一般情況下藥隔無明顯突出[4]。花藥為四孢型，成熟的花藥壁由一層表皮、一層內層、兩層中層和單層絨氈層組成。表皮宿存，內層發育成纖維狀增厚，中層是短命的，其中一層在小孢子階段變為扁平，最后被擠碎，另一層則在花藥開裂前解體；絨氈層細胞早期是單核的，而當花粉母細胞減數分裂時則成為雙核或多核的，它們在花粉單核時期開始退化，至雙核期消失[5]。楊樹性別特異的花器官發育是一個復雜的過程，但與其他被子植物花發育類似，楊樹的花發育也分為開花誘導、花的發端和花器官發育3 個受眾多基因調控的復雜過程，且它們具有相似的花器官特性基因[6]。

隨著研究的不斷深入，花器官形成的相關理論逐步完善，由最初的“ABC”模型假說發展成為“ABCDE”模型及四聚體模型，其中，A類和E類基因決定花萼特征，A、B 和E類基因一起調控花瓣發育，B、C 和E類基因共同決定雄蕊發育，C類和E類基因決定心皮發育，D類和E類決定胚珠發育[7-8]。楊樹花發育的相關器官特異性基因的作用不全同于其他開花植物，近年來調控楊樹花器官發育的多個ABCDE類基因功能被解析，如：A類基因中的AP1同源基因PTM1、PTM2和B類基因中的AP3同源基因，它們在楊樹雌/雄株中的表達有所差異，可能參與了楊樹的性別決定[9-10]；B類基因中的PI的同源基因PdPI和C類基因PTAG1和PTAG2，與楊樹花發育密切相關并且可能影響營養器官的形成和發育[6,11-12]；E類基因中的PTM3、PTM4及PTM6，在楊樹雌/雄株中花發育過程中持續表達，在胚珠、花藥原基中有著非常高的表達量[13]。

AGAMOUS(AG)是MADS-box 基因中研究較為充分的一類基因，屬于植物特有的MIKC 型C類MADS-box 基因，包括euAG/PLENA(PLE)譜系和AGAMOUS-like11(AGL11)譜系，可與其他基因互作共同控制雄蕊及心皮的發育[8,14-17]。在擬南芥中，AG可控制擬南芥花發育后期的花粉形成[18-20]。另有研究表明，在擬南芥AG突變體的花器官四輪結構中出現了第三輪結構（雄蕊）轉化為花瓣、第四輪結構(心皮)發育成一個新的花的情況，而第一、二輪的花結構(萼片及花瓣)與野生型擬南芥花器官并無差異[21-23]。另外，抑制AG會導致菠菜雄性不育[24]。而AGAMOUS(AG)及其同源基因在單性花發育的研究中鮮有報道，在毛果楊雌株中，AG（PtAG1及PtAG2）和STK（AGL11）基因在楊樹種毛發育中表現出較強的功能保守性，共同抑制種毛的形成[12]，而該基因在楊樹雄花花發育中的作用尚無報道。

本研究基于AG2在被子植物花器官的決定作用，對銀腺楊‘84K’（Populus alba×P.glandulosa‘84K’）PagAG2基因時空特異性進行了檢測，為進一步研究其在楊樹雄花花發育中的功能，進而有針對性地對楊樹生殖發育進行調控奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及相關試劑

銀腺楊‘84K’（Populus alba×P.glandulosa‘84K’）花序于2019 年2月22 日采自北京市中國林科院內（115.7°～117.4° E，39.4°～41.6° N），組培材料生長于溫度25℃、光強2300 Lx、光周期16 h/8 h 的組織培養間中；RNA 提取試劑盒購自Aidlab 公司（北京）；Premix TaqTM 酶購、反轉錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒均購自Takara 公司（日本）；固定液由50%FAA 固定液100 mL、無水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL加DEPC·H2O 定容至100 mL；RNA 預雜交液/雜交液由20×SSC 30 mL、50×Denhardt's 10 mL、10%SDS 5 mL、10 mg·mL?1Salmon DNA 1 mL、Formamide（甲酰胺）50 mL、ddH2O 4 mL，充分混勻后使用0.45 μm 濾膜去雜質后使用；抗熒光淬滅封片劑購自生工生物公司（上海）。

1.2 方法

1.2.1 銀腺楊‘84K’雄花的水培及石蠟切片制作 取‘84K’楊越冬花枝，2019 年2月22 日置于溫室水培（0 d），每日更換一次水。對水培后1 周內的花序連續采樣（0、3、4、5、6、7 d），置于PBS 固定液中立即真空抽氣固定，并依次完成脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、粘片、脫蠟步驟，以番紅—固綠法染色[25]。染色完成染色后，在光學顯微鏡（OLYMPUS 公司（BX51）產品）下觀察、拍照記錄。

1.2.2 實時定量PCR（qRT-PCR）分別提取‘84K’楊組培苗的根、莖、葉及水培后2 周內的花序連續采樣（水培后0、3、4、5、6、7 d 的花序）的總RNA，并反轉錄合成cDNA。使用熒光定量PCR 儀（Roche 公司（Light Cycle 480Ⅱ）產品）進行qRT-PCR 反應，反應體系為cDNA 模板2 μL，Primer-F(10 μmol·L?1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol ·L?1) 0.8 μL，XTB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus，2×）10 μL，ddH2O補足至20 μL。其擴增條件為預變性95℃，30s；變性95℃，5s，退火60℃，30s，40個循環；熔解曲線為95℃ 5 s，65℃ 1 min。以Actin為內參基因，每個樣品進行3 次重復，用2?ΔΔCT算法進行分析[26]，引物見表1。

表1 qRT-PCR 表達分析引物Table 1 Primers used in qRT-PCR analysis

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）基于堿基互補的原則，利用熒光原位雜交技術將細胞原位雜交技術和熒光技術有機結合，用熒光素標記的已知外源RNA 作探針，與‘84K’楊雄花組織切片雜交，與待測核酸的靶序列專一性結合，通過檢測雜交位點熒光來顯示PtAG2核苷酸序列在‘84K’楊雄花中的位置。根據待檢測目的基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設計，并用探針合成儀器（UNICORN 5.31，沃特曼）合成RNA 探針（表2），熒光素標記反義RNA 核酸探針，以正義RNA 探針為陰性對照。將‘84K’楊雄花序樣品放入配制好的固定液（50%FAA 固定液100 mL、無水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL，加DEPC·H2O 定容至100 mL）中固定12 h 后經梯度酒精脫水后浸蠟、包埋、切片（SQ2125，徠克公司）、攤片（PPTHK-21B，徠克）、撈片，62℃烤箱烤片2 h。石蠟切片脫蠟后，將切片于修復液中煮沸10～15 min，自然冷卻。滴加蛋白酶K（20 ug·mL?1）37℃消化，純水沖洗后PBS 洗3 次，每次5 min。滴加預雜交液，37℃于雜交儀（S500-24，Thermo-Brite）孵育1 h。傾去預雜交液，滴加探針雜交液，置于恒溫箱57℃度雜交過夜。洗去雜交液，2×SSC，37℃洗10 min，1×SSC，37℃洗2 次，每次5 min，0.5×SSC 室溫洗10 min。切片滴加DAPI 染液，避光孵育8 min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑（Anti-Fade Mounting Medium，生工）封片，置于熒光顯微鏡下（CX41，OLYMPUS）觀察并采集圖像（紫外激發波長330～380 nm，發射波長420 nm，發藍光；FAM(488)綠光激發波長465～495 nm，發射波長515～555 nm，發綠光；CY5 紅光激發波長510～560 nm，發射波長590 nm，發紅光）。所有試劑、儀器均需DEPC 處理。

表2 RNA 探針序列Table 2 RNA probe sequences

2 結果與分析

2.1 楊樹雄花發育形態學觀察

楊樹雄花為柔荑花序，著生于苞片腋間，雄蕊被退化的盤狀花被所包圍。‘84K’楊越冬花枝自水培之日（0 d）起，其雄花花芽迅速膨大并將苞片撐開，整個花序覆有白色絨毛（3 d），第4 天可見紅色花藥，之后整個花序繼續伸長，隨著花藥的成熟花藥顏色由紅轉為黃，由于花發育的順序由下向上，花序軸上端的花和下部的花的發育時期相差較大，雄花開始有部分花粉散出，至7 d 時，花粉大量散出，苞片脫落。水培后第0、3、4、5、6、7 天的花序度（3 個樣品）測量均值分別為0.8、2.5、3.1、3.7、6.5、8 cm（圖1）。

圖1 ‘84K’楊雄花序Fig.1 Male inflorescences of Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

從石蠟切片結果看出：取樣時楊樹雄花花藥中的單倍體的小孢子已從四分體中釋放，游離于花粉囊中，取樣0～7 d 隨花藥橫切面增大，纖維狀帶逐漸展開，絨氈層濃縮繼而解體，中層降解，至7 d 時藥隔每側的2 個花粉囊互相連通，待花粉囊開裂出現花藥裂口，成熟的花粉依而從花粉囊內散出而傳粉（圖2）。

圖2 ‘84K’楊雄花花藥切片Fig.2 Anther section of Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

2.2 PagAG2 在‘84K’楊雄花序不同發育時期及營養器官的表達分析

利用qRT-PCR 技術檢測了PagAG2在‘84K’楊不同器官及其雄花花序不同發育時期的表達差異。結果表明，PagAG2在雄花發育的過程中，水培后1 周內的花序樣品中PagAG2的表達量逐漸升高后降低，6 d 達到頂峰（圖3A），之后回落，7 d 可見PagAG2降至整個觀察期最低，藥隔兩側花粉囊互相連通、花粉成熟將大量散開花粉，這一過程十分迅速，PagAG2基因與楊樹雄花花發育密切相關。然而，值得注意的是，PagAG2在根、莖、葉這些營養器官中也有一定表達（圖3B），并且在莖中的表達量高于根和葉，但均低于整個觀察期的雄花。

圖3 PagAG2 在‘84K’楊雄花序（A）及營養器官（B）中的表達檢測Fig.3 Expression of PagAG2 inPopulus alba×P.glandulosa ‘84K’

2.3 PagAG2 在‘84K’楊雄花中的原位表達

通過原位雜交的技術手段檢測了PagAG2在楊樹雄花中的具體表達部位。用PagAG2特異性探針對‘84K’楊雄花花序進行原位雜交，洗脫后，其熒光顯微鏡鏡檢拍照結果見圖4。在樣本中可以清晰地觀察到亮綠色雜交信號覆蓋整個視野中的花序組織，而紅色陰性對照僅出現在花藥周圍的花被組織。PagAG2在‘84K’楊雄花花藥中特異性表達。

圖4 PagAG2 在‘84K’楊雄花中的原位雜交分析Fig.4 In situ hybridization analysis of PagAG2 expression in male flowers Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

3 討論

楊樹花發育過程涉及大量的基因調控，C類基因AG編碼的MADS-box 轉錄因子在其中起著關鍵作用，包括終止花分生組織的生成、調控雄蕊/心皮/胚珠的發育，并與A類基因相互拮抗[27-31]。Brunner 等[11]的研究表明，PtAG2在毛白楊雌株和雄株中的表達模式一致，表明它們不太可能在功能上與樹的性別相關，但卻對楊樹雌/雄花相關組織的形成和發育有著重要作用。本試驗中，PagAG2在‘84K’楊雄花花序中的表達具有時空特異性。通過實時定量PCR 檢測水培后0～7 d 的‘84K’楊雄花花序PagAG2基因表達量，時間上PagAG2在花組織中的相對表達量先增加后降低，從對應的雄花花序外部形態及石蠟切片上看，其表達量是隨著雄花花序發育而逐漸升高，在花藥成熟時達到頂峰，并在花粉成熟散落后降低。另外，本試驗通過實時定量檢測了PagAG2‘84K’楊根、莖、葉的表達量，利用熒光原位雜交展現了PagAG2花序中的表達部位，空間上PagAG2的轉錄水平在楊樹花序表達量高于營養器官，并且花粉為PagAG2在花序中具體表達部位，在花序中的整個花藥均有表達。PagAG2表達與‘84K’楊雄花發育密切相關，有望作為基因工程改良楊樹花粉的目標基因。植物生殖發育的整個過程在一定程度上均受到MADS-box 基因調控[32]。另外，已有研究表明，MADS-box 蛋白在楊樹營養器官生長發育中也發揮重要作用，如楊樹SVL參與營養芽休眠過程，PTM5、ADF、LRR、FPF1被證明能夠調控木質部的形成等[9,33-37]。目的基因PagAG2除可能參與楊樹雄花花發育，還可能參與楊樹營養組織的生長發育調控。實時定量PCR 試驗中，‘84K’楊幼期根、莖、葉營養組織中也檢測到了PaAG2轉錄物，但其轉錄水平低于試驗材料自水培日起到花粉成熟并大量散落的整個觀察期的花組織。已有研究表明，AG表達的水平對于確定器官身份是重要的[38]，AG的表達受其它基因的調節，如CURLY LEAF能夠阻止營養期AG在葉中表達[39]，Brunner 等[11]推測，PtAG2營養表達可能是楊樹中不太嚴格的抑制控制的結果，但該基因是否參與楊樹其他組織的某些生長發育調控，需要對其做進一步的基因功能分析。

楊樹基因組幾乎包含了擬南芥所有調控開花的主要同源基因[40-41]，在對模式植物擬南芥的研究中，發現了促進花器官發育的多聚MADS-box 蛋白復合物的形成。MADS-box 蛋白以二聚體的形式與下游靶基因結合，實現對擬南芥生長發育的調控作用，如AG、AP2和AGL1在擬南芥中能夠形成同源二聚體蛋白共同決定花器官特性[42-43]。隨著研究的深入又提出了四分子模型，即2 個MADS 蛋白形成二聚體，又分別與靶基因結合后形成蛋白四聚體，共同對花器官的建成起作用，四聚體PIAP3-SEP3-AG 控制雄蕊的分化，過表達PI-AP3-SEP3-AG 植物的營養葉轉化為雄蕊狀器官[44]，這也為其他物種中MADS-box 基因相關調控機理的研究提供了參考，楊樹PagAG2也可能與其他它因形成多聚體，共同實現復雜的調控作用。

4 結論

本研究對‘84K’楊PagAG2基因的表達模式進行了研究。時間上PagAG2表達量隨著花粉成熟先增加后降低，空間上PagAG2在楊樹花序表達量高于營養器官，并且花粉為PagAG2在花序中具體表達部位，PagAG2與‘84K’楊雄花花發育密切相關，有望作為基因工程改良楊樹花粉的目標基因，而PagAG2的轉錄物在楊樹幼期根、莖、葉組織中也能被檢測得到，其是否參與楊樹其他組織的生長發育調控，在相關育種工作中需要對該基因做進一步的基因功能分析，以便利用基因編輯等技術沉默楊樹花發育相關基因PagAG2，產生對營養生長無副作用的少花粉、無花粉表型，從而為從源頭上解決楊樹花粉過敏的問題提供一種有效途徑。