灰木蓮花藥結構和花粉發育特征

潘麗琴，郝建，徐建民，粟宏林，梁福江，張青青，姜清彬＊

(1.西南林業大學，云南 昆明 650204；2.中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心，廣西 憑祥 532600；3.中國林業科學研究院熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520)

木蘭科（Magnoliaceae）自從有自然分類以來，一直被認為是被子植物中最原始的類群，對研究有花植物的起源和系統發育有重要價值[1]。木蘭科全世界有15 屬260 余種植物，是熱帶亞熱帶地區常綠闊葉林的重要組成樹種，因各樹種存在較多的性狀交叉和形態變異，目前，在屬的界限和種的確定上仍有較大的爭議[2-3]。灰木蓮（Manglietia coniferaDandy），原產越南及印度尼西亞[4]，因其樹形優美、花大清香、干形通直、生長快、木材紋理細致易加工，我國于1960 年從越南中北部引入，因其適生性強、生長快且材性優良而在我國推廣[5]。目前主要在我國華南、福建及云南等地大規模種植，是一種優良的速生用材樹種，在建筑、家具、膠合板及紙漿生產中具有廣闊的市場前景[6]。

灰木蓮在我國引種地的花期為每年1月下旬至4月下旬，開花時滿樹繁花，但自然結實率幾乎為零，即使偶有結實，其聚合蓇葖果的絕大部分子房敗育，每果僅見十余粒甚至幾粒種子[7-8]。灰木蓮在我國結實率極低的問題，嚴重制約其大規模發展。目前，有關灰木蓮的研究主要集中于栽培繁育[5-6,9-11]、早期生長適應性[12]、材性[13]及生態效應[14-15]等方面，而對其有性生殖及種實敗育機制了解甚少，為探明灰木蓮引種條件下的種實敗育原因，擬采用石蠟切片和掃描電鏡技術，對灰木蓮花藥結構及其小孢子發育過程進行解剖觀察，以確定是否存在雄性不育的異常現象。同時，與木蘭科其他近緣種的胚胎學發育資料進行比較，為進一步確立灰木蓮的分類學地位和木蘭科系統發育的研究積累資料和提供佐證。

1 材料

本研究試驗點設在中國林業科學研究院熱帶林業實驗中心（以下簡稱中國林科院熱林中心），位于廣西壯族自治區憑祥市，屬南亞熱帶季風氣候區，年均氣溫21.5℃，≥ 10℃積溫7 500℃，年降水量1 220～1 400 mm，降水集中期為4月中旬至8月末，年均日照約1 260 h。選取中國林科院熱林中心的伏波實驗場（FB）、白云實驗場（BY）和中心樹木園（ZX）栽培的灰木蓮人工林為研究對象，各林分造林苗均為1.5 年生的實生苗，種源來自越南尚河，無病蟲侵害，健康狀況良好，均有零星結實，基本情況見表1。

表1 觀測林分基本情況Table 1 General information of the observation stands

2 方法

材料采集自中國林科院熱林中心灰木蓮試驗林，選擇8～12 年生的優良單株。2018 年10月至2020 年10月連續2 a，每隔3～6 d，采集不同發育時期花芽，體視顯微鏡解剖觀測花藥形態、結構及數量特征；剝離出花藥保存于FAA 固定液（V70%乙醇:V 甲醛:V 冰乙酸=18:1:1）抽真空固定，50%乙醇潤洗，經乙醇梯度脫水，浸蠟包埋后，旋轉切片機進行連續切片，切片厚度6～8 μm，中性樹膠封片，OLYMPUS 光學顯微鏡和OLYMPUS PM-10AD 成像系統觀察拍照。

取新鮮花藥，輕輕劃破花藥表皮，解剖針挑出花粉，將花藥和花粉粘貼于雙面導電膠布上，置于金屬樣品臺進行噴金，在掃描電鏡下觀察并拍照[16]。實驗數據使用Excel 軟件進行統計分析。

3 結果與分析

3.1 雄蕊群數量結構及形態特征

灰木蓮雄蕊群具花藥平均98 枚(n=30，sd=21)，花藥長平均7.4 mm (n=30，sd=1.2)，花藥寬平均2.1 mm(n=30，sd=0.2)。雄蕊群的花藥獨立分離、輻射螺旋狀排列于花軸的基部（圖1-1），花粉囊呈絲管狀平行排列于花藥內側或側向面的兩邊，無花絲，尖端伸出約1～1.5 mm 的藥隔（圖1-3）。成熟花藥具4～6 個花粉囊，多數為4 個花粉囊，偶見6 個花粉囊（圖1-2）。

圖1 花藥結構Fig.1 The structure of anthers

具有活力的花粉粒兩側對稱，異極，極面觀為橢圓形或長圓形，赤道面觀為舟形，具遠極單溝，溝直達端部，閉合或不閉合，極軸約25.5 μm，赤道軸約62.3 μm，花粉壁光滑，極軸面具稀疏穴狀紋飾（圖1-4～5），失活花粉粒縮為球形，花粉壁皺縮（圖1-6）。

3.2 花藥壁的發育

灰木蓮雄蕊原基約12月下旬至1月初開始分化，內側花粉囊較外側的分化發育早（圖2-1）。最初的花藥原基只有一層外表皮細胞和表皮內部分生組織，1月中旬，隨著內部分生組織細胞的分化，在花藥四個角隅處分化出孢原細胞（圖2-2）；孢原細胞經平周分裂形成初生壁細胞和內層初生造孢細胞（圖2-3），初生壁細胞分裂后形成3～4 層花藥壁細胞（圖2-4）；當小孢子母細胞形成時，花藥壁發育完成，此時的花藥壁自內向外分別為絨氈層1～2 層、中層1 層、藥室內壁2 層、表皮細胞1 層（圖2-5）；2月上旬，小孢子母細胞進入減數分裂，中層細胞逐漸解體、退化或變成長條狀或殘跡，絨氈層在形成四分體時也開始部分原位變形，但中層細胞較絨氈層細胞提前被吸收（圖2-6～7），絨氈層屬較原始的腺質型；小孢子從四分體釋放后發生變形，但隨著細胞增殖擴大，殘余的絨氈層和中層細胞重新恢復并被擠壓為扁平狀（圖2-8～9）；變形小孢子發育后期多數能發育正常，此時中層和絨氈層再次解體為其發育提供營養，花粉成熟時，藥室內壁發育為纖維層1 層，中層和絨氈層被吸收（圖2-10～11）；3月初，小孢子發育成熟，花粉囊纖維層徑向加厚，同側花粉囊連接處細胞壁較薄，受機械牽拉，花粉從同側兩花粉囊連接處散出（圖2-12）。

3.3 小孢子的發生及雄配子體的形成

小孢子母細胞在減數分裂前，與花藥壁細胞有明顯區別，細胞體積最大，核大，胞質濃厚，為行使小孢子母細胞功能儲備物質（圖3-1）。第1 次減數分裂末期，小孢子細胞質從外向內發生縊裂，形成二分體，但未見細胞新壁形成（圖3-2）；進入第2 次減數分裂時，二分體發生同時或不同時縊裂形成四分體，四個子細胞被共同的胼胝質包圍（圖3-3）；隨著胼胝質溶解，小孢子彼此分開并形成細胞新壁（圖3-4）。四分體的排列方式以左右對稱型和四面體型為主（圖3-5～7），偶見直列型（圖3-8），小孢子母細胞胞質分裂方式為修飾性同時型和連續型兼有。

圖3 小孢子的發生及雄配體子的形成Fig.3 The occurrence of microspore and the formation of male gametophyte

從四分體釋放后的小孢子形態發生不同程度的變形，出現扭曲、收縮或變為腎型，細胞壁薄，細胞質液泡化（圖3-9～10）；變形小孢子細胞壁進一步擴張、加厚，形成形狀規則、無液泡的單核小孢子，胞質變濃且分布均勻（圖3-11）；隨后小孢子細胞質出現液泡化形成一個中央大液泡，細胞核被擠到細胞的邊緣，此時小孢子為單核靠邊期（圖3-12）；經歷單核靠邊期后，小孢子核物質不斷積累，隨即發生1 次不均等的有絲分裂，分裂過程中可觀察到染色體從赤道面被拉向兩極，將細胞質分成不均等的兩部分而形成具營養核和生殖核的二核小孢子（圖3-13～15）；二核小孢子發育后期，大液泡消失，大部分細胞質和營養核形成營養細胞，小部分細胞質和生殖核形成生殖細胞，營養細胞占據花粉的絕大部分體積（圖3-16），成熟小孢子形成。

3.4 花藥發育過程中的敗育

通過對灰木蓮花藥發育的解剖觀察，在其發育過程中主要存在以下異常現象：（1）小孢子母細胞進入減數分裂到四分體形成時，絨氈層和中層細胞提前解體（圖4-1），僅剩少量殘余，不能為小孢子后期發育提供營養，經切片數量統計，此異常現象比例約占14%。（2）花粉壁收縮變形，形成心型花粉嚢，從四分體分離的小孢子因過度扭曲變形不能再正常發育（圖4-2～3），因變形而敗育的小孢子約占9%。（3）在小孢子母細胞分裂時期，小孢子母細胞因退化、發育異常或消失，空心花粉嚢的比例約占10%（圖4-4）。

圖4 雄配子體發育過程中的異常現象Fig.4 The abnormal phenomenon in the process of male gametophyte development

4 討論

灰木蓮的雄蕊含花藥平均98 枚，4～6 個小孢子囊呈線型或蝴蝶型排列于扁平花藥的向心面或側向面，其花藥開裂同時具側向開裂和內向開裂2 種方式。在較為原始的雙子葉植物中，整個雄蕊為具3 條維管束的扁平葉狀，花粉囊則著生于近軸面的中脈與側脈之間。據統計，進化后95%的被子植物具單脈雄蕊，這被認為是葉狀雄蕊在寬度和脈跡減少的進化過程中的產物[17]。已報道的木蘭科花粉嚢數均為4 個，且數量較穩定[4,18]，本研究觀察到灰木蓮花藥橫切結構具4～6 個花粉嚢，其花粉嚢數目具一定的可變性，這在木蘭科其他植物中尚未見報道。通常認為，花部數目多數和不定數是原始性狀，少數和定數是進化性狀[19]，這表明灰木蓮的花粉嚢數量在系統演化中保留了更為原始的性狀。在植物的系統發育中，不同器官的演化速度是不同的，因而造成同一分類群在具有原始特征的同時，又兼具有許多進化特征，被稱為異步進化或鑲嵌進化現象，這在原始的有花科植物中表現得最明顯[20]。同已報道同屬的紅花木蓮(M.insignis)、大果木蓮(M.grandis)和毛果木蓮(M.hebecarpa)相比，就花藥特征而言，灰木蓮花藥數目較少，屬較進化類型，但其花粉嚢數目卻比紅花木蓮、大果木蓮和毛果木蓮的原始[21-22]。

灰木蓮的花藥壁由表皮、藥室內壁、中層和絨氈層組成，中層和絨氈層僅由1～2 層細胞組成，腺質絨氈層，成熟花粉粒為二細胞型，這和已報道其他木蓮屬的花藥發育特征基本相同[21,23-26]。花粉壁光滑，極軸面具極稀疏穴狀紋飾，為木蓮屬中的最原始類型，花粉極軸約25.5 μm，屬木蓮屬中花粉極軸的最短區間，花粉赤道軸約62.3 μm，處于木蓮屬花粉赤道軸范圍的中等區間[27]。在灰木蓮的小孢子發育過程中，小孢子母細胞減數分裂具連續型和同時型2 種方式，連續型分離的小孢子以左右對稱型和直線型排列方式為主，同時型分裂出的小孢子為四面體型排列，而其他木蘭科樹種一般僅具一種同時型的胞質分裂方式[21,24-25,28]。灰木蓮小孢子在四分體時發生收縮變形，剛釋放的小孢子呈扭曲、梭狀或骨形，這與紅花木蓮、西疇含笑（Michelia coriaceaChang et B.L.Chen）和凹葉厚樸（Magnolia officinalisRehd.et Wils）的四分體變形特征相似[21,25,28-30]，西疇含笑和凹葉厚樸的大部分小孢子因收縮過度而不能再進一步正常發育，但在灰木蓮和紅花木蓮中，大多數小孢子在發生不規則的收縮變形的同時進行液泡化過程，因此，大部分小孢子仍能正常發育形成花粉粒。潘躍芝等認為，這種收縮現象可能是為了將細胞質擠到細胞的邊緣，以有利于細胞核有絲分裂的進行[21,25]，此現象發生的機理和作用如何？是否為更進化的類型？需進一步系統的研究。

木蘭科作為原始被子植物的現存類群，花粉敗育與結籽率低是木蘭科瀕危植物生殖失敗的原因之一[31]，對其瀕危機制研究發現，許多屬在花粉發育中存在不同環節的敗育現象，如紅花木蓮因次生造孢細胞、花粉母細胞部分敗育和二分體敗育，其花粉萌發率僅為14.7%；毛果木蓮存在花粉量少，且因原生質提前解體形成無細胞核不規則的敗育花粉率為29%[31]；香港木蘭（M.championii）的小孢子敗育率較高，四分體到單核花粉形成期出現異常發育[32-33]；凹葉厚樸在小孢子形成時，母細胞膠合在一起不能發生減數分裂，或是分離出的小孢子因過度收縮變形不能形成正常花粉粒，或是部分花粉囊在二核花粉形成時，花藥壁的絨氈層和中層細胞仍未退化完全而缺乏繼續發育的營養物質[28]；觀光木（Tsoongiodendron odorumChun）的花粉發育敗育，主要發生于從四分體分離出小孢子時，同側花粉囊有50%的四分體退化，35%的小孢子因過度收縮發育為敗育的小孢子[34]。本研究中，灰木蓮小孢子發育的敗育主要發生于四分體時期，絨氈層和中層細胞提前解體，花粉囊萎縮，剛釋放的小孢子呈扭曲、梭狀或骨形而致使部分小孢子不能發育為正常花粉粒的敗育率為33%。

生殖敗育是植物引種栽培條件下常發生的問題，其原因是多方面的。灰木蓮在自然狀態結實率幾乎為零，但對其異株異花授粉的結實率可達57.67%[35]，本研究所觀察到的灰木蓮花粉敗育率為33%，這雖然在一定程度上減少了其授粉機率，但若按其花粉胚珠比1 146 來計算，每胚珠獲得的花粉量概率依然很大。因此，花粉敗育對其結籽率較低的影響是有限的，栽培區內是否缺少足夠量的有效傳粉昆蟲，有待今后進一步研究證實。

5 結論

灰木蓮花藥結構和發育特征與其他木蓮屬相似，但在花粉囊結構、胞質分裂方式和小孢子四分體排列方式表現不同，小孢子發育過程的異常現象主要發生于四分體時期，為引起灰木蓮花粉敗育和結實率低的原因之一。