遼寧義縣奉國寺主殿壁畫彩繪膠料的氣相色譜質譜聯用分析研究

黃建華，楊 璐，劉 成，陳欣楠，張志新

[1.秦始皇帝陵博物院，陜西西安 710600；2.陶質彩繪文物保護國家文物局重點科研基地(秦始皇帝陵博物院)，陜西西安 710600；3.西北大學文化遺產學院，陜西西安 710069；4.文化遺產研究與保護技術教育部重點實驗室(西北大學)，陜西西安 710069；5.陜西國際商貿學院，陜西西安 712046]

0 引 言

奉國寺位于遼寧省錦州市義縣縣城東北部，是我國第一批全國重點文物保護單位，作為“遼代木構建筑”的重要組成部分，2012年入選世界文化遺產預備名錄[1]。該寺廟始建于遼開泰九年(公元1020年)，是遼朝圣宗皇帝耶律隆緒在母親蕭太后(蕭綽)的“家族封地”所建的皇家寺院[2]。其初名咸熙寺，金代改稱奉國寺，因主殿供奉七尊大佛，故又名七佛寺、大佛寺。奉國寺主殿建于3 m高的臺基之上，坐北朝南，面闊九間(48.2 m)，進深十架椽(25.13 m)，高21 m，建筑面積1 829 m2[2-3]。主殿正面中央7間開3門4窗，背面明間開門，其余部分用厚墻封閉。殿內供奉有七尊彩繪泥塑主佛，代表佛教中的“過去七佛”。山墻內壁繪有大幅通頂元代壁畫，畫面內容為須彌山座佛像。兩檐柱間為一幅，共20幅，總面積達466.7 m2[4]。該壁畫規模宏大、藝術水準高，是研究元代繪畫藝術的珍貴實物資料，具有極高的藝術價值和歷史價值。

膠料是壁畫彩繪層的重要組成部分，起分散及固著顏料的作用[5]。中國古代壁畫使用的膠料多為蛋白質類材料，主要包括以動物組織、皮膚或骨骼為原料熬制而成的動物膠，以及雞蛋和奶類3種。這些材料屬于天然有機高分子化合物，易隨文物的老化出現降解、流失的現象，進而造成壁畫彩繪層顏料的剝落，導致不可挽回的損失。因此，對包括壁畫在內的彩繪文物的保護常常會涉及使用具有一定黏結力保護試劑的加固過程。但因為文物的珍貴性和不可再生性，對其進行的保護、修復應遵循“原材料、原形制、原工藝、原做法”的“四原”原則[6]，其中“原材料”是首要原則。這就要求在進行壁畫保護之前對其原構成材質，包括膠料種類進行分析研究。

本研究采用氣相色譜質譜聯用儀(簡稱GC-MS)對遼寧義縣奉國寺大殿壁畫彩繪層文物樣品進行了分析，利用GC-MS的高分離效率、高靈敏度、低檢出限的特性，研究了3件文物樣品膠料的氨基酸組成，在此基礎上引入多元統計分析對其膠料的種類進行了判別。研究為深入了解奉國寺元代壁畫制作工藝提供了重要資料，同時為該類文物保護修復材料的選擇提供了指導。

1 樣品和方法

1.1 實驗材料及試劑

古代使用的膠料多為天然有機物，參考樣品的選擇以常見的古代彩繪膠料為依據，選取現代樣品或依據古代傳統工藝制備。用作參考樣品的動物膠以新鮮豬皮為原料，在實驗室按照傳統工藝熬制而成；雞蛋和牛奶均購自西安市場。采用現代樣品作為膠料分析的參考樣品是該類材料分析鑒別的通用做法[5]。另外，據相關前期研究表明，就本研究所采取的實驗方法，不同哺乳動物的皮或骨熬制出的動物膠不存在會造成類別誤判的差異[7]。

實驗用以建立工作曲線的12種標準氨基酸，包括：丙氨酸(Ala)2.5 mmol/L、甘氨酸(Gly)2.5 mmol/L、纈氨酸(Val)2.5 mmol/L、亮氨酸(Leu)2.5 mmol/L、異亮氨酸(Ile)2.5 mmol/L、絲氨酸(Ser)2.5 mmol/L、脯氨酸(Pro)12.5 mmol/L、天冬氨酸(Asp)2.5 mmol/L、苯丙氨酸(Phe)2.5 mmol/L、谷氨酸(Glu)2.5 mmol/L、羥脯氨酸(Hyp)12.5 mmol/L、正亮氨酸(Nor)2.5 mmol/L(內標物)，以及衍生化試劑N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(簡稱MTBSTFA)，均購自美國西格瑪公司；萃取用氨水購自四川西隴化工有限公司，純度為分析純；水解用鹽酸購自西安化學試劑廠，純度為分析純；衍生化反應用吡啶購自天津市光復精細化工研究所，純度為色譜純；衍生化反應用三乙胺購自天津市科密歐化學試劑有限公司，純度為色譜純；樣品凈化用Agilent OMIX C4固相萃取柱購自美國安捷倫公司。

1.2 樣品處理及分析

將自制的動物膠和購買的雞蛋、牛奶作為常用3類蛋白膠料的參考樣品，分別取少量(約10 μg)置于試管中，向其中加入200 μL 2.5 mol/L的氨水，超聲波輔助萃取蛋白類物質。吸取萃取液并在氮氣保護下蒸干，用100 μL三氟乙酸再次溶解，并用Agilent OMIX C4柱吸附溶液中的蛋白類物質。使用甲酸-甲醇-水(0.1%∶75%∶25%，V/V)對C4柱吸附的蛋白進行洗脫。洗脫液氮氣吹干后，加入6 mol/L HCl在160 ℃下微波輔助水解30 min。取出水解液后向其中加入內標物正亮氨酸。氮氣保護干燥后再向其中加入10 μL含有1%TMCS的MTBSTFA、40 μL吡啶和2 μL三乙胺，于60 ℃下反應30 min[8]。最后吸取2 μL樣品上機分析。

1.3 儀器及測試條件

萃取使用的KQ-50E型超聲波清洗器由昆山市超聲儀器有限公司生產。水解使用的Milestone ETHOS ONE型微波水解儀由意大利邁爾斯通科技有限公司生產。氨基酸組成分析使用的Agilent 7890A-5975C型氣相色譜質譜聯用儀由美國安捷倫科技有限公司生產，具體配置及參數如下：色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；載氣為He(99.999%)，流速1.5 mL/min；升溫程序為初始溫度100 ℃，保持2 min后以6 ℃/min的速度升溫至280 ℃；模式選擇為不分流；進樣量2 μL；離子源EI；質譜采集模式：SIM。各氨基酸選擇離子的荷質比為，丙氨酸：158，232；甘氨酸：147，218；纈氨酸：186，260；亮氨酸：200，302；異亮氨酸：200，302；絲氨酸：362，390；脯氨酸：184，286；苯丙氨酸：302，336；天冬氨酸：302，418；羥脯氨酸：314，416；谷氨酸：330，432。

數據的因子分析使用美國IBM公司出產的IBM SPSS Statistics 22軟件進行。

2 結果與討論

2.1 參考樣品及文物樣品的氨基酸組成

據相關記錄，20世紀80年代，曾經采用1%聚乙烯醇縮丁醛對壁畫進行過加固處理。聚乙烯醇縮丁醛屬人工合成的有機高分子材料，其成分與古代常用于膠料的天然高分子化合物差異顯著，經過適當的萃取、純化過程不會影響樣品原始膠料的分析測試結果。實驗使用干凈的手術刀在奉國寺大殿東壁壁畫表面采集嚴重起翹幾近剝落的彩繪層樣品，并將其封裝入玻璃容器中運回實驗室進行膠料的氨基酸組成分析。共采集了藍色(7.29 mg)、綠色(5.99 mg)和紅色(5.05 mg)3件不同顏色的彩繪層樣品，編號分別為FGS-1、FGS-2和FGS-3，見圖1。文物樣品的前處理過程見2.2。

圖1 壁畫文物樣品采樣部位

圖2～圖4是3件文物樣品GC-MS分析的選擇離子流圖。從圖中可以看出，文物樣品的色譜峰型對稱，不同色譜峰間的分離度較好，色譜基線平整。這說明色譜分離條件適合，以該色譜圖為基礎進行的積分及定量分析結果可靠。

圖2 編號FGS-1樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖3 編號FGS-2樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖4 編號FGS-3樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

為了探明常見蛋白類膠料的氨基酸組成特征，為奉國寺壁畫膠料種類的鑒別提供依據，實驗分析了動物膠、牛奶、雞蛋3種膠料參考樣品的氨基酸組成，3種參考樣品的典型選擇離子流圖見圖5～圖7。參考樣品各氨基酸平均組成及3件文物樣品的氨基酸組成結果見表1。

圖5 動物膠參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖6 雞蛋參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖7 牛奶參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

表1 參考樣品及文物樣品膠料的氨基酸組成均值

從表1中可以看出，作為蛋白類膠料的參考樣品，動物膠、雞蛋、牛奶的氨基酸組成各有特點。動物膠具有特殊的一種氨基酸——羥脯氨酸[9]。此外，動物膠中還含有較多的甘氨酸，其平均值為28.76%，遠遠超過該氨基酸在牛奶和雞蛋中的含量。因此，含有羥脯氨酸且具有高含量的甘氨酸是動物膠氨基酸組成的明顯特征。牛奶中谷氨酸的含量較高，其平均值達到24.5%，遠高于其他兩種膠料的該氨基酸含量。此外，牛奶中的丙氨酸含量在3種參考樣品中相對較低，5.53%的平均值僅為另外兩種膠料該氨基酸含量的近乎一半。雞蛋中天冬氨酸的含量較另外2種參考膠料高，其平均值達到了16.48%。此外，雞蛋中脯氨酸的含量較低，9.82%的平均值較另兩種膠料略低。

從3件文物樣品的氨基酸分析結果可以看出，編號為FGS-1和FGS-3樣品的各氨基酸組成相似度較高，編號為FGS-2的樣品雖個別氨基酸與另2件文物樣品有所差異，但整體基本相似。從表1中可以看出，3件文物樣品中均含有羥脯氨酸，但含量均較低；3件文物樣品甘氨酸的含量也較高，均超過了20%。從這兩種氨基酸來看，文物樣品均具有動物膠的特征。但樣品FGS-2的脯氨酸含量異常高，甚至超過了動物膠參考樣品的平均值。同時，該樣品谷氨酸的含量異常低，低于所有參考樣品的平均值。此外，FGS-1和FGS-3樣品的谷氨酸含量較高，高于動物膠中該氨基酸的平均含量，介于雞蛋和牛奶之間。因此，通過個別氨基酸組成特征的數值僅能判斷3件文物樣品疑似具有動物膠的特點，但尚無法確認其膠料種類。造成這個問題的原因是，表1中獲得的是11種氨基酸的組成信息，而通過個別氨基酸進行判斷僅使用了數據的部分信息，將其他大量數據簡單舍去，造成了數據的損失，自然會影響判斷結果。

2.2 文物樣品膠料氨基酸組成的因子分析

因子分析是一種常用的多元統計方法，是通過尋找多維數據方差最大的線性組合而進行數據的降維，從而實現數據信息量損失最小化前提下的簡化處理，使多元的復雜數據得以較簡單、直觀的表達[10]。為了最大限度地利用文物樣品膠料各氨基酸組成數據，實驗將表1中3件文物樣品的氨基酸組成數據與實驗室參考樣品的數據一起構成數據矩陣，引入因子分析法對該數據集進行降維分析，結果見表2。

表2 文物樣品膠料氨基酸組成比因子分析的特征值

從表2中可以看出，文物樣品膠料氨基酸組成比的因子分析中前兩個因子的累積方差百分比已經達到78.49%，且第3個因子的特征值已小于1。這說明前兩個因子已經能夠代表原始數據11種氨基酸總信息量的78%，再增加第3個因子對因子分析的貢獻不大[11-12]。因此，實驗選用文物樣品的前兩個因子得分為坐標，與參考樣品一起繪制因子得分散點圖，見圖8。

從圖8中可以看出，3件文物樣品的因子得分散點均落在了動物膠區域。這說明文物樣品11種氨基酸的綜合組成特征與動物膠非常相似，也印證了2.1中對個別氨基酸特征的分析判斷。但文物樣品的散點并不位于動物膠的中心區域，而是落在了邊緣，甚至有脫離動物膠類別的趨勢。為了探明造成3件文物樣品散點位置偏移的原因，實驗采集了本次分析的因子載荷矩陣，結果見表3。

圖8 奉國寺壁畫文物樣品氨基酸組成的因子得分散點圖

表3 奉國寺壁畫文物樣品因子分析的因子載荷矩陣

從表3中可以看出，造成因子散點向Factor1軸負向移動最主要的因素是甘氨酸和羥脯氨酸，而向Factor1軸正向移動最主要的因素是異亮氨酸和亮氨酸；造成因子散點向Factor2軸負向移動最主要的因素是谷氨酸和脯氨酸，而向Factor2軸正向移動最主要的因素是丙氨酸和絲氨酸。

從圖8中還可以看出，3件文物樣品落在動物膠邊緣的主要原因是其較動物膠類別散點向Factor1軸正向的偏移。基于前文的討論，該偏移可以由兩方面因素解釋。一方面，可以解釋為文物樣品較動物膠含有更多的異亮氨酸和亮氨酸，從而造成樣品較動物膠向Factor1軸正向偏移；另一方面，可以解釋為文物樣品較動物膠含有較少的甘氨酸和羥脯氨酸，從而造成樣品較動物膠向Factor1軸負向偏移不足。結合表1中文物樣品的實測數據可以看出，文物中異亮氨酸和亮氨酸的含量高于動物膠參考樣品，其平均值差別為2倍左右。此外，文物樣品與動物膠參考樣品的甘氨酸含量差異不大，但羥脯氨酸差距顯著，平均值差別在10倍以上。由此可知，造成文物樣品因子得分散點圖偏移至動物膠邊緣的主要原因是，文物中羥脯氨酸含量遠小于參考樣品，而異亮氨酸和亮氨酸的含量略高于參考樣品。

羥脯氨酸是動物膠特有的一種氨基酸，是動物膠維持分子構型及膠黏性的重要氨基酸。但羥脯氨酸并不穩定，易因多種原因發生老化，轉化為其他氨基酸。例如，羥脯氨酸(Hyp)的分子結構與脯氨酸類似，很容易因老化脫掉羥基而變為脯氨酸(Pro)。另外，羥脯氨酸還會在特定酶促進的氧化作用下轉化為羥谷氨酸(Hyg)，進而脫羥基變為谷氨酸(Glu)[13-14]，見圖9。

圖9 羥脯氨酸老化降解方式

從表1中可以看出，3件文物樣品的羥脯氨酸含量均遠低于動物膠參考樣品，這說明文物樣品膠料出現了明顯的老化。文物樣品FGS-2主要發生了羥脯氨酸的脫羥基老化作用，其反應產物為脯氨酸，因此可以解釋表1中該樣品脯氨酸含量較高的現象。而文物樣品FGS-1和FGS-3主要發生了羥脯氨酸的酶促氧化反應，其反應產物脫羥基后為谷氨酸，故可以解釋該樣品的谷氨酸含量較動物膠明顯偏高的現象。酶促氧化反應一般需要在羥脯氨酸脫氫酶的作用下進行[14-15]。而微生物多會通過分泌特定的酶發生作用，故推測這2件文物樣品有可能滋生過某種微生物。

3 結 論

通過對3件奉國寺壁畫樣品氨基酸組成的GC-MS分析，結合因子分析發現奉國寺壁畫使用膠料的氨基酸組成特征與動物膠參考樣品接近，即均含有Hyp且Gly含量較高。但樣品FGS-2的Pro含量異常高，樣品FGS-1和FGS-3的Glu含量較動物膠高。依據樣品因子散點圖位置和氨基酸組成特征，發現3件文物樣品落在動物膠邊緣的主要原因是文物中Hyp含量小于參考樣品，而Leu和Ile的含量略高于參考樣品。Hyp易因老化而減少。其老化方式之一是脫羥基變為Pro，FGS-2中Pro的高含量就是其Hyp脫羥基老化的結果。此外，Hyp還會在特定酶和氧氣的作用下轉化為羥谷氨酸，進而脫羥基變為Glu。FGS-1和FGS-3中Glu的較高含量應是發生了Hyp酶促氧化反應的結果。據此推測奉國寺壁畫膠料出現了一定程度的老化。根據Hyp的酶促氧化反應一般需要羥脯氨酸脫氫酶，而微生物多會通過分泌特定的酶發生作用，推測樣品FGS-1和FGS-3很有可能曾經滋生過某種微生物。