5′- 核苷酸酶與慢性乙肝患者肝損傷的關系

陽建華，王芬，張文崇

（1.上栗縣中醫院，江西 上栗 337000；2.奉新縣中醫院，江西 奉新 330700）

慢性乙肝是指乙肝病毒（HBV）持續感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病，世界上感染過乙肝的人數超過20 億，該病早已成為全球性的公共衛生問題[1]。 盡管我國實施的乙肝防治策略有效的降低了HBV 感染率，但由于人口基數大，仍面臨巨大的疾病防控壓力[2]。 肝臟解剖位置及生理功能特殊，易受多種因素影響導致肝損傷，而慢性乙肝患者肝損傷越嚴重，其生存質量越低[3,4]。循證醫學證明，早期篩檢、不斷診斷檢測、后續追蹤治療等方法可有效控制慢性乙肝病情發展，甚至可逆轉肝硬化進程[5]。 肝穿刺活檢是目前評估慢性乙肝肝損傷的金標準，有創的穿刺活檢可能導致大出血等嚴重并發癥，患者常常難以接受[6]；目前常用血清學指標敏感性和特異性仍存在不足[7]。 因此，尋找可以反應組織學形態的變化，并且具備一定靈敏度及特異性的指標是當前的研究熱點。 研究表明，肝病患者血清中可檢測到5’-核苷酸酶（5’-NT）活性明顯增高，但其應用于肝損傷的報道仍然較少[8]。 本研究檢測并分析了慢性乙肝患者血清5’-NT 水平對肝損傷的預測效果，以期找到慢性乙肝肝損傷潛在預測標志物。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料 選擇2020年4月至2021年6月我院收治的慢性乙肝患者300 例進行研究，其中男性184 例，女性116 例，平均年齡41.02±11.31歲，根據相關癥狀及生物化學檢查結果，將其分為輕度損傷組104 例、 中度損傷組139 例及重度損傷組57 例；對照組為同期治療的非活動性乙肝表面抗原（HBsAg）攜帶者/慢性乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者80 例，其中男性48 例，女性32 例，平均年齡39.63±10.56歲。 納入研究的慢性乙肝患者和對照組的性別、年齡等一般資料具有可比性（P＞0.05），所有病例均經充分知情并簽署知情同意書，研究通過我院倫理委員會審批。

1.1.2 入選和排除標準 入選標準：⑴根據《慢性乙型肝炎診斷標準（2015年版）》[9]進行診斷，①輕度損傷：ALT≤3×ULN（正常上限升高倍數），膽紅素（BIL）17.1～34.2 mol/L，白蛋白（ALB）≥35 g/L，凝血酶原活動度（PTA） 79～71（%）；②中度損傷：ALT 3～10×ULN，BIL 34.2～85.5 mol/L，ALB 33～34 g/L，PTA 61～70（%）；③重度損傷：ALT＞10×ULN，BIL＞85.5 mol/L，ALB≤32 g/L，PTA 40～60（%）；中、重度損傷認為具有顯著肝損傷。 ⑵既往未接受抗乙肝病毒治療； ⑶此次發病就診前未接受護肝降酶等治療。

排除標準：⑴乙肝病毒感染病史不明確者；⑵出現腹膜炎等嚴重感染的并發癥患者； ⑶合并HIV、寄生蟲、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨細胞病毒及其他嗜肝病毒等感染者；⑷合并藥物性肝炎、 酒精性肝病、 自身免疫性肝炎、肝臟腫瘤等肝臟疾病患者；⑸合并妊娠、甲狀腺功能亢進、精神性疾病、呼吸系統疾病、心腎功能不全、自身免疫性疾病等其他系統疾病；⑹近1年內曾接受或正在接受免疫調節藥物治療，或存在其他原因引起免疫系統功能異常者。

1.2 血清指標檢測 所有病例于就診治療初采集清晨空腹新鮮外周血送檢，采用AU480 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司） 檢測ALT、AST 等肝功能指標；同時抽取外周血4 ml 于含分離膠促凝管，3000 r/min 離心10 min 后，分別取上層血清4 份，每份200 μl，置于Eppendof 管中，-80℃條件下存放，待檢。 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法測定HBV DNA，設備為Veriti7500實時熒光定量PCR 儀（ABI Thermo 賽默飛世爾）；采用酶聯免疫吸附測定法檢測所有患者血清5’-NT。

1.3 統計學處理 使用SPSS 25.0 進行數據分析，計量資料以（均數±標準差）表示，多組采用單因素方差分析進行比較，兩組則采用t 檢驗比較；計數數據以n（%）標示，應用卡方（χ2）檢驗進行分析。采用Pearson 相關進行相關性分析；通過單因素及多因素Logistic 回歸考察肝損傷的影響因素； 繪制ROC 曲線確定5'-NT 的對肝損傷的診斷效能。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肝損傷影響因素分析 將所有慢性乙肝患者分為顯著肝損傷和輕度肝損傷并進行比較，結果發現ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平存在差異（P＜0.05），而不同肝損傷患者的性別和年齡無明顯差異（P＞0.05）。 見表1。

表1 不同肝損傷影響因素分析

2.2 各組病例ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平比較 單因素方差分析可知，不同肝損傷病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平具有顯著差異（P＜0.05），發生肝損傷的病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平均顯著高于對照組病例（P＜0.05），且隨損傷程度加深，各指標水平呈現遞增趨勢。 見表2。

表2 不同肝損傷病例ALT、AST、HBV DNA 及5′- NT 水平比較

2.3 5'-NT 與ALT、AST 及HBV DNA的相關性Pearson 相關顯示，5'-NT與慢性乙肝ALT（r=0.506，P＜0.001）及AST（r=0.524，P＜0.001）呈顯著正相關，而與HBV DNA 無明顯相關性（P＞0.05）。見表3。

表3 5′- NT 與ALT、AST 及HBV DNA 的相關性

2.4 多因素Logistic 回歸分析 以不同肝損傷情況為因變量（顯著肝損傷=1，輕度肝損傷=0），自變量為單因素分析中具有顯著影響的因素，其賦值分別為：ALT （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、AST （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、HBV DNA （＞5.3 lg copies/ml=1，≤5.3 lg copies/ml=0）及5'-NT（＞12.20 U/L=1，≤12.20 U/L=0） 進行多因素Logistic 回歸分析，結果ALT （OR=3.813，95%CI 1.281-11.350）、AST（OR =4.512，95% CI 1.540 ～13.220）、HBV DNA（OR=3.624，95%CI 1.215～10.808）及5'-NT（OR =3.936，95%CI 1.341～11.554） 是影響顯著肝損傷發生的獨立危險因素。 見表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析

2.5 各參數對肝損傷的診斷效能 以發生顯著肝損傷賦值為1，輕度肝損傷則賦值0，繪制各參數預測肝損傷的ROC 曲線，結果顯示5'-NT 的ROC曲線下面積為0.876，約登指數為0.65，其敏感度和特異性均達到80%以上，對肝損傷具有最高的診斷效能。 見圖1 和表5。

圖1 各參數對肝損傷的診斷效能的ROC 曲線

表5 各參數對肝損傷的診斷效能表5 各參數對肝損傷的診斷效能

3 討論

肝損傷常見類型有藥物性、 酒精性及免疫性肝損傷，其中免疫性肝損傷表現為機體開始排斥自身肝組織，一旦肝組織出現炎癥性損傷時，會導致相應的抗體在血清中出現；目前，對于免疫性肝損傷病因尚不清楚，但有很多患者可以迅速發展為肝硬化和肝衰竭[10]。 HBV 引起的肝損傷屬于免疫性肝損傷；HBV 是一種非細胞毒性病毒，并不直接引起肝損傷，而是由于感染HBV 后引起人體細胞免疫和體液免疫應答造成的，是由機體針對HBV 特異性抗原的免疫反應所引起，因此，機體的免疫狀態變化會使得HBV 感染所致的臨床結果發生變化[11]。 故慢性乙肝難以從單獨的臨床表現確診，需綜合病史、特定的實驗室檢查及組織學觀察予以診斷。 因此，篩查出與慢性乙肝發生肝損傷相關的生物標志物具有極大的臨床意義。

5’-NT 是一種分布于肝臟的膽小管、 竇狀隙以及各種組織細胞膜內的特異性磷酸酶，可通過炎癥抑制、A2A 受體調控、調節性T 細胞等多種途徑參與機體免疫，免疫抑制活性廣泛；5’-NT 在肝細胞受損或肝內外受阻時才能釋放入血，而其他細胞組織不會釋放5’-NT，且其他合并系統臟器疾病并不能影響血中5’-NT 的濃度，故血清5’-NT 對于肝臟疾病具有重要的診斷價值[12,13]。劉少平等[14]研究表明，5’-NT 在肝癌組織中水平高于良性肝病患者，二者均較健康人高；鄧霽紅等[15]研究發現，乙肝患者的血清5’-NT 水平顯著高于健康人群，且隨著HBV-DNA 載量增加，5’-NT 水平有所增加，但其研究中并未發現血清5’-NT 和HBVDNA 間的明顯關系。 而本研究不同程度肝損傷病例的5'-NT 水平差異顯著，發生肝損傷的病例的5'-NT 水平均顯著高于對照組病例（P＜0.05），且隨損傷程度加深，5'-NT 水平呈現遞增趨勢，提示不同程度的慢性乙肝導致的肝損傷引起血清5'-NT水平發生了明顯變化，這也再次證明血清5'-NT可能是慢性乙肝肝損傷的診斷標志物。

ALT 和AST 是臨床上應用最廣泛的肝損傷生化指標，當致病因子導致肝細胞發生變形，細胞膜通透性進而改變則會引起ALT 的升高，而AST 上升會晚于ALT，一般需肝損傷波及到線粒體時才會出現[10]。 HBV DNA 是HBV 感染的特異性指標，其水平高低可用于直接評估HBV 復制程度[16]。HBV 病毒的反復入侵導致免疫清除/激活長期持續出現，進而誘發肝硬化，而血清HBV DNA 水平可預測HBV 慢性感染者的肝硬化發病率，肝硬化的發病率以劑量依賴方式，隨HBV DNA 水平的增加而升高[17,18]。 Pearson 相關顯示，5'-NT 與慢性乙肝ALT （r=0.506，P＜0.001） 及AST （r=0.524，P＜0.001）呈顯著正相關，而與HBV DNA 無明顯相關性（P＞0.05）。說明5'-NT 與肝功能有良好的的相關性，可能是反映肝臟炎癥及其他損傷程度，但并未證明HBV-DNA 與肝功能間明顯聯系，故5'-NT與HBV 復制能力無明顯關系，具體仍有待進一步研究予以證實。

研究還發現，顯著肝損傷患者的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平顯著高于輕度肝損傷患者（P＜0.05）； 多因素Logistic 回歸結果可知ALT（OR =3.813，95% CI 1.281 -11.350）、AST （OR =4.512，95% CI 1.540 -13.220）、HBV DNA （OR =3.624，95% CI 1.215 -10.808） 及5' -NT （OR =3.936，95%CI 1.341-11.554） 是導致慢性乙肝患者出現顯著肝損傷的獨立危險因素。 由此可知，5'-NT 可用于慢性乙肝肝損傷的預測生物標志物。 為確定其診斷效能，以血清5'-NT 水平12.20 U/L 作為預測的臨界值繪制ROC 曲線，結果5'-NT 的曲線下面積為0.876，敏感度和特異性均超過80%，與ALT、AST 及HBV DNA 相比具有最大的約登指數，說明5'-NT 對于慢性乙肝肝損傷表現出較高的診斷效能。 但慢性乙肝影響因素眾多，常需結合多種指標進行綜合評估，有報道5'-NT 聯合其他多項指標可提高肝癌的陽性診斷率[19]，故5'-NT 在實際應用時亦可借鑒參考。

綜上，血清5'-NT 水平升高可能提示慢性乙肝患者肝損傷加重，可作為預測慢性乙肝肝損傷的新型生物標志物。