膽石癥膽汁成份及OPN 活性變化、血清瘦素變化與結石形成的關系研究

馬興樂，劉海潮，李會轉

（鄭州大學附屬洛陽中心醫院肝膽胰脾疝外科，河南 洛陽 471009）

膽石癥屬于消化系統常見病，其中膽固醇結石屬于最常見的類型，隨著人們飲食結構及生活方式的變化，膽石癥的發病率呈顯著升高趨勢[1]。膽固醇從膽汁析出并結晶是膽固醇結石的首要形成條件，其中抑制或促進膽固醇成核過程的多種因子均具有重要的調節作用。 骨橋蛋白（osteopontin,OPN）廣泛存在于多種細胞和組織中，屬于磷酸化的糖蛋白，研究[2]提示膽汁OPN 作為重要的抑核因子，具有延長膽固醇成核、結晶的作用。 瘦素是機體脂肪代謝的重要因子，膽固醇由肝細胞代謝并由膽道排出，膽汁濃縮于膽囊內，促進膽固醇析出、結晶和沉淀，因而80%膽固醇結石存于膽囊[3]。 但現階段關于膽囊結石與OPN、瘦素等因子的研究資料較少，OPN、 瘦素在膽固醇結石的形成過程中如何發揮作用尚存在爭議。 故而，本研究探討了膽固醇結石患者膽汁成份、 膽汁中OPN 活性及血清瘦素的變化及在膽結石形成中的作用，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月-2018年8月本院經手術治療的膽固醇結石患者60 例（膽石癥組，n=60）、60 例因膽囊息肉實施手術治療的患者（息肉組，n=60）。 膽石癥組，年齡37～69歲，平均52.2±6.8歲；性別構成：男21 例、女39 例；結石最大徑6.2±1.9mm；其中膽囊結石單發13 例、多發47例。 息肉組，年齡39～69歲，平均54.0±6.1歲；性別構成：男25 例、女35 例。 兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），研究經本院醫學倫理委員會批準，符合醫學倫理學要求。

1.2 相關標準 診斷標準[4]：膽固醇結石患者的診斷標準參考《外科學》人民衛生出版社第八版中的標準。 納入標準：⑴患者年齡39～69歲；⑵膽囊結石和膽囊息肉患者均在我院接受腹腔鏡下膽囊切除手術；⑶手術前未使用降膽固醇相關藥物、非甾體類抗炎藥、生長抑素等藥物；⑷本研究符合《赫爾辛基宣言-人體醫學研究的倫理準則》。 排除標準：⑴膽囊及膽管、肝臟部位的惡性腫瘤；⑵膽道寄生蟲病；⑶嚴重的肝腎功能疾病；⑷近3 個月內具有肝膽系統的炎癥病史； ⑸伴有其他系統的重大疾病。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者全麻建立氣腹, 進入光纖鏡頭,在鏡頭引導下置入劍突下及肋緣下戳卡，無損傷鉗提起膽囊，適度降低氣腹壓力，使膽囊底貼近腹壁，鏡頭引導下胸穿針自腹壁刺入膽囊底，抽取膽汁5ml，荷包縫合膽囊穿刺點后膽囊及腹壁穿刺點消毒。 分裝與無菌管中，低溫離心15min，1500G/min，去除雜質及沉淀，加入膽汁保存液（0.05%氯霉素，3mM 疊氮鈉，1mM 亮抑酶肽和5mM 依地酸鈉），深低溫保存，分批檢測。

1.3.2 檢測方法 膽汁組分濃度檢測 膽汁標本室溫解融后，全自動生化分析儀（美國GE 公司生產）檢測兩組膽汁中總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）水平；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清瘦素水平，OPN 濃度檢測采用ELISA 法，相關試劑盒均購于南京建成生物研究所，檢測過程嚴格按照試劑及儀器說明書進行。

膽汁成核時間檢測 成核時間檢測參照HOLAN 等人的方法，膽汁標本室溫解融后，超速離心，濾過膜過濾(0.22μm)，吸取膽汁460μl 加入檢測管，然后依次加入OPN （2.5mg/ml）、 白蛋白（5mg/ml）、 氯化鈣(250μmol/L 各20μl，37℃平衡30min 后每12h 在偏光顯微鏡下觀察析出情況及時間為成核時間。

1.4 統計分析 本研究中所有數據的分析均采用SPSS21.0 版本，年齡、膽汁酸中TC、TBA 水平等指標采用±s 表示，組間比較采用t 檢驗；性別比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson 線性相關分析法；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較 經兩組獨立樣本t 檢驗，膽石癥組患者的膽汁酸中TC、TC/TBA 水平顯著高于息肉組（P＜0.05），膽石癥組和息肉組患者的膽汁酸中TBA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；見表1。

表1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較（±s）

表1 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中TC、TBA 水平比較（±s）

組別 n膽石癥組息肉組t 值P 值60 60 TC（mmol/L） TBA（mmol/L）13.28±1.66 11.43±1.20 6.996 0.000 122.8±31.9 135.2±38.0-1.936 0.055 TC/TBA 0.108±0.022 0.085±0.028 5.112 0.000

2.2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時間及血清瘦素水平比較 經兩組獨立樣本t 檢驗，膽石癥組患者的血清瘦素水平顯著高于息肉組（P＜0.05）； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度、成核時間均低于息肉組患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）；見表2。

表2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時間及血清瘦素水平比較（±s）

表2 膽石癥組患者和息肉組患者的膽汁酸中OPN蛋白濃度、成核時間及血清瘦素水平比較（±s）

組別 n OPN 濃度（ng/ml）OPN 蛋白成核時間（d）膽石癥組息肉組t 值P 值60 60 69.41±6.52 82.50±7.78-9.989 0.000 17.51±2.04 20.83±1.20-10.866 0.000血清瘦素（ng/ml）8.40±2.73 5.28±1.50 7.759 0.000

2.3 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度 血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 的相關性 經Pearson 線性相關分析法分析，膽石癥組患者的血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈顯著正相關關系（P＜0.05）；膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈負相關關系（P＜0.05）；見表3。

表3 相關性分析結果

3 討論

膽囊動力學異常、膽固醇結晶水合物沉著、膽囊膽汁成核、 過飽和均是形成膽固醇結石的主要生理病理機制，其中膽固醇結晶沉淀是結石形成的最關鍵環節[5,7]。 正常條件下，膽囊膽汁中的膽固醇主要以膽固醇磷脂泡及微膠粒的形式保持溶解狀態，但是膽汁中的膽固醇超過大泡的最大承載力，膽固醇將析出、結晶和沉淀，而膽汁酸與膽固醇、磷脂的相對濃度比決定了膽固醇的溶解度。

本研究結果顯示膽石癥組患者的膽汁酸中TC、TC/TBA 水平顯著高于息肉組，膽石癥組和息肉組患者的膽汁酸中TBA 水平差異無統計學意義。,提示在膽囊結石的形成過程中，膽汁中膽固醇的濃度具有決定性的作用，其主要原因是膽固醇的濃度過高或過飽和，而非膽汁酸的濃度下降，提示在膽固醇結晶析出的過程中，膽汁中膽固醇濃度過高是主要的因素。

OPN 屬于分泌型磷酸化糖蛋白，能夠調節機體的病理生理過程，其在膽囊、肝臟及膽汁中均存在高表達，近年來才有學者[8-10]提出OPN 可能參與了膽石癥的發生、發展過程。 本研究結果顯示膽石癥組患者的血清瘦素水平顯著高于息肉組； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度、 成核時間均低于息肉組患者，差異具有統計學意義。 該結果說明膽石癥患者瘦素水平較高、OPN 水平較低且OPN結構上也可能存在差異，導致成核時間縮短及抑制膽固醇結石形成的能力下降。 肝內膽管結石患者的腺體及結石均發現OPN 表達，OPN 能夠抑制膽汁膽固醇的結晶生長，穩定磷脂泡和膽固醇，進而抑制膽固醇的析出。 瘦素是脂肪細胞分泌的激素，最初發現預脂肪細胞，瘦素受體可廣泛表達于全身各組織，因此瘦素在全身的各個臟器組織均可發揮作用。 動物實驗[11-13]發現狗膽囊結石的形成及膽囊囊腫均與瘦素及其受體關系密切，既往的研究認為[14]，瘦素能夠清除脂肪中的膽固醇，加速體內的膽固醇的排泄，因此能夠引起膽汁中的膽固醇過飽和，從而更利于膽固醇結晶的形成，但在膽汁中瘦素的表達情況尚少有研究，在本組資料中膽囊結石組膽汁中瘦素的水平增高，考慮其可能通過對膽汁中膽固醇代謝的干擾促進膽固醇結晶的析出，而且其尚可能通過調節膽囊收縮素的作用影響膽囊的排空功能[15]，進而存進膽囊結石的形成。

進一步對膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度 血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 的相關性研究發現膽石癥組患者的血清瘦素水平與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈顯著正相關關系； 膽石癥組患者膽汁酸中OPN 蛋白濃度與膽汁酸中TC、TC/TBA 呈負相關關系。 該結果提示膽固醇結石患者膽汁中OPN 蛋白的濃度及活性減低、 血清瘦素水平升高, 可能與膽汁成份失調、 膽結石形成有關[16.17]。

綜上所述，膽固醇結石患者膽汁中OPN 蛋白的濃度及活性減低、血清瘦素水平升高，并且與膽汁中TC 及TC/TBA 的比值具有相關性，而在兩組患者的膽汁中TBA 的水平并未表現出明顯的差異。 研究結果提示在膽囊結石形成的過程中，膽汁中的膽固醇濃度過高引起的過飽和現象是主要的因素之一，而OPN 的濃度過低，能夠影響膽汁泡的穩定性，導致晶體的析出，此外瘦素能夠通過對膽固醇代謝的調節以及對膽囊收素的調節等途徑參與膽囊結石的形成過程。 提示在膽囊結石手術過程中，通過對膽汁中上述成分的檢測，能夠為膽囊結石形形成提供進一步的基礎理論，也能夠為術后的藥物干預提供參考依據。