慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞中TLR2/4- NFκB 及IRAK1/4 信號通路變化研究

李航，黃昊

（開封市中心醫院 檢驗科，河南 開封 475000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的主要特征為持續性氣流受限且多呈進行性發展，并伴有肺功能進行性減低，還可伴隨心血管疾病、代謝綜合征等并發癥[1]。 研究表明，相關炎癥信號通路激活、炎癥因子異常表達在氣道壁和肺實質損傷中具有關鍵性作用[2]。 Toll 樣受體（TLRs）是機體重要的模式識別受體之一，而核因子κB（NF-κB）位于TLRs 下游信號通路的關鍵位置，TLRs-NF-κB 信號通路過度激活情況下可導致炎癥反應失控，參與呼吸道及肺組織損傷、破壞[3]。 白細胞介素-1 受體相關激酶（IRAK）可介導包括TLRs 在內的多細胞受體信號，在多種炎癥細胞信號轉導網絡中具有重要調節作用[4]。 本研究通過檢測COPD 患者外周血單個核細胞（PBMCs）中TLR2/4-NF-κB 及IRAK1/4 信號通路表達，旨在探討其在COPD 發病中的作用，為COPD 的防治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所有受試者均自愿參與且簽署知情同意書，研究設計經醫院倫理委員會審核批準通過。 選取2018年1月至2019年6月期間，在本院就診并符合入選標準的COPD 患者90例：納入標準：⑴符合COPD 的臨床診斷標準[5]；⑵年齡≥40歲； ⑶近期未使用激素類藥物。 排除標準：⑴合并哮喘、肺結核等其他呼吸系統疾病者；⑵肺部及其他臟器系統惡性腫瘤病史或先病者；⑶合并嚴重心、腦、肝、腎及血液系統疾病者；⑷合并高血壓、糖尿病等其他慢性疾病者；⑸結締組織病、寄生蟲感染者。參照相關診療指南[5,6]，根據是否處于急性發作期分為穩定期組（n=48）與急性加重期組（AECOPD 組，n=42）2 個亞組。

另選同期在本院接受健康體檢的性別、年齡匹配的志愿者90 例作為正常對照組，納入標準：⑴肺功能正常，無呼吸系統病史；⑵既往身體健康狀況良好，無慢性疾病史、惡性腫瘤史。 排除標準：⑴重要臟器器質性病變； ⑵近2 個月內發燒或其他感染性疾??； ⑶經體格檢查及胸X 線片檢查顯示異常者。

1.2 檢測方法

1.2.1 PBMCs 提取 所有受試者均隔夜空腹8h 以上，晨取空腹外周靜脈血5 ml，以肝素鈉抗凝，采用Ficoll Hypaque 密度梯度離心法（轉速2000r/min 離心30min）離心，留取白膜層細胞，采用PBS洗滌2 次，1500r/min 離心10min，獲取PBMCs。

1.2.2 TLRs、NF-κB 及IRAK mRNA 檢 測 采 用Trizol 法提取RNA，逆轉錄反應后采用實時PCR技術檢測TLRs、NF-κB 及IRAK mRNA 表達，PCR儀為美國Bio-Rad 公司提供。 反應體系包括4 種dNTPs 混合液各2.5μl，上下游引物各0.4μl，cDNA模板1.2μl，Taq DNA 聚合酶1 U，加入滅菌水至總體積20μl。 反應 條件：95℃30s→95℃5s→60℃25s，循環40 次。 試劑盒由Promega 生物技術公司生產，溶解曲線反應條件：95℃15s→60℃1min→95℃15s。 內參對照為GAPDH，引物由賽默飛世爾科技公司提供。 檢測TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1 和IRAK-4 mRNA 表達，引物設計：（1）GAPDH 上游序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3’，片段大小121bp；（2）TLR-2 上游序列5’-CGGAAGATAATGAACACCAAGAC-3’, 下游序列5’-AGATCCCAACTAGACAAAGACTG-3’，片段大小139 bp；（3）TLR-4 上游序列5’-CCTGTCCCTGAACCCTATGA-3’, 下 游序列5’-CTTCTAAAC CAGCCAGACCTT-3’ ，片段大小137 bp；（4）NFκB 上游 序 列5’-AGGATTTCGTTTCCGTTATGT -3’，下游序列5’-CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC-3’，片段大小92 bp；（5）IRAK-1 上游序列5’-TGAGGAACACGGTGTATGCTG-3’，下游序列5’-GTTTGGGTGACGAAACCTGGA-3’，片段大小119 bp； （6）IRAK -4 上 游 序 列5’ -CCTGACTCCTCAAGTCCAGAA-3’，下游序列5’-ACAGAAATGG GTCGTTCATCAAA-3’，片段大小119 bp。

1.2.3 結果判定 獲得電泳帶以Fluor Chem V2.0電容膠成像分析軟件進行分析，即5μL 3%瓊脂糖凝膠（0.1%溴乙錠）經電泳分析PCR 終產物，采用2-△△CT法計算目標基因相對表達量，△CT=目標基因△CT-參照△CT，相對量（RQ）=2-△△CT。

1.2.4 血清炎癥因子檢測 受試者均晨取外周靜脈血4ml，3000r/min 離心10min 分離血清，保存于-80℃冰箱中統一待測。 采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）測定血清白介素（IL）-1β、-6、-8 及腫瘤壞死因子α（TNF-α），BK-EL10C 全自動酶聯免疫分析儀及其配套試劑由山東博科醫療器械有限公司提供。

1.3 統計學分析 數據采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。 計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較經單因素方差分析，進一步兩兩比較經LSD-t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，比較經χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COPD 組與對照組的臨床特征比較AECOPD組中,男33 例,女9 例；年齡45～75歲，平均62.31±8.14歲；病程3～15年，平均11.31±5.17年；第一秒用力呼氣量占所有呼氣量的比例（FEV1/FVC）為43%～60%，平均49.42±5.16%。 COPD 穩定期組中，男40 例，女8 例；年齡45～75歲，平均60.49±7.96歲；病程2～16年，平均11.52±5.01年；FEV1/FVC為48%～66%，平均58.82±6.74%；對照組中，男68例，女22 例；年齡45～75歲，平均58.98±7.43歲；FEV1/FVC 為82%～89%，平均83.66±8.02%。 三組的一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 COPD組與對照組的TLRs、NF -κB、IRAKs mRNA 表達水平比較COPD 組的PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平均高于對照組，且AECOPD 組高于穩定期組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 COPD 組與對照組的TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達水平比較（±s）

表1 COPD 組與對照組的TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與穩定期比較，#P＜0.05。

COPD 穩定期(n=48)1.81±1.02*1.14±0.85*1.02±0.31*1.01±0.33*1.00±0.32*項目 對照組(n=90) F P 值TLR-2 TLR-4 NF-κB IRAK-1 IRAK-4 AECOPD(n=42)2.83±2.26*#1.62±1.14*#1.54±0.85*#1.43±0.32*#1.39±0.31*#0.91±0.42 0.83±0.36 0.35±0.11 0.65±0.17 0.41±0.15 659.01 301.14 588.17 418.05 512.03＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較COPD 組的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均高于對照組，且AECOPD 組高于穩定期組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較（±s）

表2 COPD 組與對照組的血清炎癥因子譜比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與穩定期比較，#P＜0.05。

項目 AECOPD(n=42)IL-1β(μg/L)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)5.23±1.49*#98.21±10.21*#323.01±101.56*#176.42±35.72*#COPD 穩定期(n=48)3.81±1.07*60.05±8.19*108.32±10.14*94.62±8.12*對照組(n=90)1.82±0.44 30.13±6.32 71.12±6.78 58.05±6.44 F 191.43 391.04 458.09 259.14 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 COPD 患者血清炎癥因子譜與TLRs、NF-κB、IRAKs mRNA 表達的相關性COPD 患者血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 均 與TLR-2、TLR-4、NFκB、IRAK-1、IRAK-4 呈正相關性，且與FEV1/FVC呈負相關性（P＜0.05）；且TLR-2、TLR-4、NF-κB、IRAK-1、IRAK-4 與FEV1/FVC 呈負相關性（P＜0.05），TLR-2/4、NF-κB、IRAK-1/4 之間互呈正相關性（P＜0.05）。 見表3。

表3 COPD 患者血清炎癥因子譜與TLRs、NF- κB、IRAKs mRNA 表達的相關性（r）

3 討論

COPD 的發病機制目前尚不完全明確，多認為與慢性支氣管炎、 長期肺泡上皮細胞及平滑肌上皮細胞重塑、肺氣腫等密切相關，尤其是有吸煙史者具有更高的COPD 發病率[7]。 在感染等刺激因素下，COPD 發展為AECOPD 可在短期內出現肺功能惡化，導致嚴重并發癥（肺動脈高壓、肺心病等）發生風險升高,增加病死率或遠期不良預后風險[8]。因此，研究COPD 尤其是AECOPD 發生及發展的相關生物學機制，對于COPD 的治療及急性發作的防治具有積極參考價值。

臨床研究表明, 免疫-炎癥反應紊亂是COPD的重要發病因素和急性加重因素之一[9]。TLRs 參與天然免疫、獲得性免疫應答的調節,且在多種炎癥反應過程中細胞信號傳導、細胞吞噬作用、細胞凋亡等具有重要調節作用[10]。TLR-2 和TLR-4 是TL Rs 的主要亞型, 已有研究證實其在COPD 患者中具有明顯高表達,推測其與COPD 患者的肺血管重塑及持續氣道炎癥反應密切相關[11]。 核轉錄調控因子NF-κB 在TLRs 信號傳導中起著關鍵作用，大量細胞因子的生成與釋放有賴于TLRs 所誘導的NF-κB 信號通路激活[12]。本研究結果顯示,COPD 患者PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NF-κB 均處于高表達水平,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。 提示TLR2/4-NF-κB 信號通路過度激活與COPD 的發生及發展有關。 與此同時，AECOPD 患者的TLR-2、TLR-4、NF-κB mRNA 表達水平均高于穩定期組（P＜0.05）, 表明AECOPD 患者的TLR2/4-NF-κB 信號通路激活可能較穩定期COPD 更為明顯。 考慮為AECOPD 多在感染、有害氣體或顆粒刺激等情況下發生，而上述因素均可激活TLR/NFκB 信號通路而擴大炎癥反應，引起不可控性炎癥反應或炎癥反應持續，可誘發肺部病理性改變或肺損傷。 IRAKs 家族是TLRs/IL-1 信號級聯家族的重要成員，在TLRs/IL-1 信號通路中發揮著連接、樞紐作用，其中，以IRAK1 和IRAK4 的作用尤為關鍵[13]。 本研究中，COPD 組PBMCs 中IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平均較對照組明顯升高，且在AECOPD 組中表達較穩定期COPD 組進一步升高（P＜0.05），證實IRAK-1/4 信號通路在COPD 尤其是AECOPD 中呈高度活化狀態，并大量參與氣道炎癥過程。 考慮為COPD 患者長期處于氣道炎癥等刺激作用下，呼吸道固有免疫功能受抑，導致患者對細菌的易感性增加，更容易發生呼吸道反復感染，而害氣體或物質、感染等刺激可進一步激活TLR2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路，故在AECOPD患者中具有更明顯的TLR2/4-NF-κB、IRAK-1/4 過表達，這對COPD 的長期控制及AECOPD 的預防提供了一定的理論依據[14]。 相關性分析顯示，COPD 患者的TLR-2/TLR-4 與NF-κB、IRAK-1/4 之間均呈正相關性（P＜0.05），提示TLR2/4-NF-κB 與IRAK-1/4 信號通路可能通過某種相互作用而參與COPD 的發生及發展過程。

細胞因子異常表達已被證實與COPD 氣道炎癥的發生及持續具有密切關系，尤其是在肺部感染或COPD 急性發作情況下，多種細胞因子可呈現指數性上升，且其變化幅度與病情嚴重程度密切相關[15]。IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 均是經典促炎細胞因子，具有多生物活性，已有研究證實上述因子可介導或擴大 “瀑布效應”，參與氣道炎癥反應的持續及氣道重塑[16]。 本研究中，COPD 患者的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均高于對照組，且AECOPD 高于COPD 穩定期（P＜0.05）,與王志英等[17]報道基本相符,說明系統性炎癥反應在COPD的發生及發展中具有重要作用，且炎癥反應加劇可能與COPD 急性加重發作有關。 進一步相關性分析顯示，COPD 患者的血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平均與PBMCs 中TLR-2、TLR-4、NFκB、IRAK-1 及IRAK-4 mRNA 表達水平呈正相關性（P＜0.05）。 提示在COPD 患者可能長期受到定植菌刺激或存在DAMPs，TLR-2/TLR-4 可能識別并活化NF-κB，或IRAK-1/4 激活NF-κB 而介導下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等的釋放，炎性介質或細胞因子又可進一步活化淋巴細胞、激活中性粒細胞等,使氣道炎癥持續或加重。 同時，研究還顯示，血清炎癥因子及TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 表達水平均與FEV1/FVC 呈負相關性（P＜0.05），郭太平等[18]也獲得了相似結論，證實炎癥反應程度與肺功能關系密切。 由此可見，炎癥TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路過度激活及其介導的下游炎性因子高表達與COPD 的發生及病情程度存在一定關聯，監測TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路活化情況及其下游炎癥因子表達對COPD 的病情評估具有指導意義。

綜上所述，COPD 患者存在明顯TLR-2/4-NFκB、IRAK-1/4 信號通路激活，在PBMCs 中呈明顯高表達，與氣道炎癥反應持續或加重密切相關，且與COPD 的急性加重、肺功能減低有一定關系。 監測TLR-2/4-NF-κB、IRAK-1/4 信號通路及相關因子表達變化，對COPD 的發病機制研究、臨床管理及急性加重的防治具有一定參考價值。