TGFB1 和TLR4 mRNA 在糖尿病腎病患者外周血單核細胞中的表達及其與病情嚴重度的關系

陳雪輝，王迪，孟祥雨，海潔

（新鄉醫學院第一附屬醫院內分泌科，河南 衛輝 453100）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見的微血管并發癥，是終末期腎病的主要原因之一[1]。 在中國，DN發病率呈現快速增長的趨勢[2]。 有研究顯示，DN 發生發展與機體炎性反應、 免疫系統紊亂等密切相關[3]。 轉化生長因子B1（TGFB1）是介導DN 腎小球硬化的主要細胞因子。 在血管緊張素、高血糖的刺激下，糖尿病患者TGFB1 mRNA 表達被激活，引起細胞外基質集聚，導致腎小球硬化[4]。 Toll 樣受體4（TLR4）是Toll 樣受體成員之一，可刺激炎性因子的轉錄和合成，激活炎癥反應系統，促進炎癥因子的釋放[5]。 本研究主要探討TGFB1 mRNA 和TLR4 mRNA 在DN 患者外周血單核細胞中的表達及與病情程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年12月-2018年12月于本院門診和住院治療的186 例2 型糖尿病患者為研究對象，其中男性85 例，女性101 例，年齡39～81歲，平均55.26±7.12歲。 排除標準：⑴合并遺傳性腎病、 急性腎小球腎炎等疾病患者； ⑵合并心、肝等重要臟器功能障礙者；⑶合并糖尿病其他嚴重并發癥患者。 參照《中國2 型糖尿病防治指南（2013年版）》[6]及《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》[7]中的2 型糖尿病診斷及DN 診斷、臨床分期參考標準，將2 型糖尿病患者分為單純2 型糖尿病組（A 組）62 例；早期DN 組（B 組）47 例；臨床期DN 組（C 組）42 例；腎衰竭期組（D 組）35 例。 另選取同時期于本院體檢的60 例健康人群作為對照組，男性27 例，女性33 例，年齡40～78歲，平均年齡54.68±6.49歲。 各組患者性別、年齡和BMI 比較,差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組患者性別、年齡和體重指數比較

1.2 體格檢查 測量所有受試者血壓、 身高和體重，并計算體重指數（BMI）。 BMI=體重（kg）/身高2（m2）。

1.3 血液標本采集和臨床指標檢測 采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血5ml，全自動生化儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、血肌酐，高效液相法檢測糖化血紅蛋白（HbAlc）。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測外周血單核細胞TGFB1mRNA 和TLR4mRNA 表達 使用天津灝洋生物制品科技有限責任公司的人單核細胞分離液分離外周血單核細胞，參照說明書進行操作。 采用RNA 抽屜試劑盒提取外周血單核細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度。 參照逆轉錄試劑盒將其合成為cDNA，并以cDNA 為模板，進行擴增。擴增條件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72℃30 s，共35 個循環。 引物序列：TGFB1 上游5'-CGAGCCCTGGACACCAATCA-3'，下 游5' -AGGCAGAAATTGGCGTGGTA -3'；TLR4上游5'-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3'，下游5'-TCAAAGATACACCAACGGCTC -3'；β -actin 上游5'-GTAAA GACCTCTATGCCAACA -3'，下 游5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT -3'。 以β-actin 為內參，2－△△Ct法計算TGFB1 和TLR4 的mRNA 相對表達水平。

1.5 統計學分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實驗數據。 計量資料以均數±標準差（±s）表示。 兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。 多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。兩組連續變量相關性采用Pearson 相關性分析。 多因素Logistic 回歸分析影響DN 的危險因素。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組研究對象外周血單核細胞TLR4、TGFB1 mRNA 表達水平的比較 單因素方差分析顯示，各組研究對象外周血單核細胞TLR4、TGFB1 mRNA表達水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較顯示，外周血單核細胞TLR4、TGFB1 mRNA 表達水平，D 組顯著高于C 組、B 組、A 組、對照組（P＜0.05），C 組顯著高于B 組、A 組、對照組（P＜0.05），B 組患者顯著高于A 組、 對照組（P＜0.05），A 組患者顯著高于對照組（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組研究對象TLR4、TGFB1 mRNA 表達水平的比較（±s）

表2 各組研究對象TLR4、TGFB1 mRNA 表達水平的比較（±s）

分組對照組A 組B 組C 組D 組總例數 TLR4 mRNA相對表達量50 62 47 42 35 1.05±0.08 1.26±0.11 1.84±0.19 2.25±0.23 3.12±0.34 TGFB1 mRNA相對表達量1.04±0.05 1.37±0.13 1.65±0.18 2.31±0.25 2.97±0.31

2.2 DN 患者外周血單核細胞TLR4、TGFB1 mRNA表達水平與各指標的相關性分析DN 患者外周血單核細胞TLR4 mRNA、TGFB1 mRNA 表達水平與血清TG、TC、LDL-C，FBG，全血HbAlc 等指標呈顯著正相關（P＜0.05），與血清HDL-C，eGFR 等指標呈顯著負相關（P＜0.05），與年齡、病程、體重指數、收縮壓、舒張壓等指標無顯著相關性（P＞0.05）。 見表3。

表3 DN 患者TLR4、TGFB1 mRNA表達水平與各指標的相關性分析

2.3 影響DN 發生發展的多因素Logistic 回歸分析血清LDL-C，FBG，HbAlc，外周血單核細胞TLR4、TGFB1 mRNA 是DN 發生發展的獨立危險因素（P＜0.05），血清HDL-C 是DN 發生發展的獨立保護因素（P＜0.05）。 見表4。

表4 影響DN 發生發展的多因素Logistic 回歸分析分析

3 討論

糖尿病屬于代謝紊亂性炎性疾病，炎癥在糖尿病并發癥的發生發展中起重要作用。 TGFB1 是目前公認的腎臟促纖維化因子。 研究顯示，DN 組患者血清TGFB1 水平明顯高于單純糖尿病患者，與腎臟病理改變的嚴重程度呈正相關,原因可能與高糖誘導系膜細胞TGFB1 mRNA 表達激活有關[8]。抑制TGFB1 等信號通路可減輕炎性反應，從而減輕和延緩腎間質纖維化[9]。 TLR4 是介導炎癥反應的關鍵跨膜蛋白，在腎疾病中發揮重要作用。 研究顯示，抑制TLR4 表達可降低高糖誘導的足細胞炎性因子表達和細胞外基質集聚，延緩DN 進展[10]。本研究顯示，DN 患者外周血單核細胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達均高于健康體檢者，且TGFB1 和TLR4 mRNA 表達水平隨著DN 患者病情的嚴重程度逐漸增加，不同階段DN 患者中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達水平差異顯著，提示外周血單核細胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達水平可反映DN 患者病情嚴重程度，對于該疾病的診斷具有重要價值。機體內升高的脂質沉積在腎小球基底膜，會刺激膜底膜細胞增殖和細胞外間質生成，導致腎小球硬化和間質損害[11]。 有報道稱，脂代謝紊亂是DN的危險因素，HDL-C 降低、TG 和LDL-C 的異常升高是DN 進展的獨立危險因素[12,13]，與本研究結果一致。 本研究還顯示，DN 患者外周血單核細胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表達均與TG、TC、LDLC 指標呈正相關，與HDL-C 呈負相關。

HbAlc 是血液中紅細胞內的血紅蛋白與葡萄糖經非酶促反應結合的產物,其合成速度較慢而且不可逆轉，HbAlc 值能反應檢測前8～12 周的平均血糖水平,且與血糖升高程度及持續時間呈顯著正相關，常輔助FBG 對糖尿病進行診斷，以及對糖尿病血糖控制效果進行評估[14]。 本研究顯示,FBG 和HbAlc 水平升高是影響DN 發生發展的危險因素，與相關研究報道結果一致[15,16]。 DN 患者外周血單核細胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表達與FBG 和HbAlc 水平呈正相關，說明TLR4 和TGFB1 也可用于反映糖尿病腎病的嚴重程度。

綜上所述，TGFB1 和TLR4 mRNA 在DN 患者中呈高表達，并且DN 患者病情越嚴重，其表達越高，兩者均是影響DN 發生發展的危險因素。