妊娠期糖尿病患者血清、胎盤組織及臍血中PECAM- 1 表達及臨床意義

高立娟，劉巧香，王華莉

（河南省平頂山市平煤神馬醫療集團總醫院產科，河南 平頂山 467099）

妊娠期糖尿病（GDM）是最常見的妊娠并發癥之一，占所有妊娠的1%～14%[1,2]。 GDM 婦女其他妊娠并發癥風險增加，包括妊娠高血壓、糖尿病性酮癥酸中毒,產后2 型糖尿病、子代成年后患糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等代謝疾病[3]。 GDM 具有胰島素抵抗（IR）特性，在診斷為GDM 的婦女中，IR 比例升高[4]。 研究表明，全身和局部炎癥在GDM 患者IR 的發展中起著重要作用。 研究表明，血小板內皮細胞黏附分子-1 （platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）是分泌的剪接變體，該變體識別病原體相關分子模式（PAMP）以及組織損傷的內源性指標，PECAM-1 是抑炎反應的關鍵介質[5]。 PECAM-1 可抑制NF-κB,活化蛋白1（AP-1）和干擾素調節因子（IRFs）在內的幾種轉錄因子而導致促炎性細胞因子的弱表達。 這些細胞因子可以直接或間接抑制胰島素靶細胞中的胰島素作用[6]。 PECAM-1 是IR 中潛在的分子功能。 在糖尿病動物模型以及T1DM 和T2DM 患者中觀察到PECAM-1 的表達降低。 以前的研究還發現GDM患者中PBMC, 骨骼肌和脂肪組織中PECAM-1 的表達明顯下降。 此外,激活PECAM-1 信號傳導可以改善IR[7,8]。 也有研究發現肝細胞特異的PECA M-1 過表達可減輕飲食引起的全身和局部IR[9]。本研究擬探討GDM 患者血清、 胎盤組織及臍血中PECAM-1 表達及臨床意義，為GDM 的發病、治療機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年8月至2019年9月，平煤神馬醫療集團總醫院96 例行剖宮產手術的妊娠期糖尿病孕婦為病例組，根據國際糖尿病與妊娠研究小組（IADPSG）標準在妊娠24～28 周時通過口服葡萄糖耐量試驗（75 g）對妊娠期糖尿病進行診斷，并根據國際婦產科聯合會（FIGO）建議進行飲食管理和生活方式調整以及藥物干預（二甲雙胍、胰島素）。 根據年齡、BMI、身高、體重、妊娠周數進行匹配選取2016年8月至2019年9月本院96例行剖宮產手術的正常孕婦為對照組。 該研究得到本院倫理委員會的批準和審查，剖宮產前已獲得研究對象知情同意書。 納入標準：⑴單身妊娠；⑵年齡18～40歲；⑶符合IADPSG 診斷標準；⑷研究對象自愿提供血清、胎盤組織及臍血；⑸經過本院醫學倫理協會批準。 排除標準：⑴多胎妊娠；⑵感染或其他妊娠并發癥； ⑶先天性或染色體異常或糖尿病家族史。

1.2 方法

1.2.1 血清及臍帶血中PECAM-1 表達水平測定用TRIzol 試劑 （美國Invitrogen Life Technologies公司，批號：SD-77896.36）從血清及臍帶血中提取總RNA。 使用TaqMan mRNA 試劑盒（美國Applied Biosystems，批號：CV-556963.36） 將總RNA逆轉錄為互補DNA （cDNA）。 PECAM-1、GAPDH引物由華大基因合成，序列如下：PECAM-1F：5'-TGCTAGCTAGTCGCGTCGATCGTGATCGATGCTA GCT -3' 和R：5'-TCGCGCTGCGTCGTCGATGCTA GCTCGTCGTAGCTCGATG-3'; GAPDHF：5'-CTCCGCTACTAGCTGCTAGCTGCTAGCTAGTCGCTAG CTGCA-3' 和R：5'-TCGCTAGCTAGTAGCTAGCTGACTGATCGTCG-3'。 使用SYBR Green 試劑盒（中國碧云天生物科技，批號：XS-559686.36）以及7300 實時PCR 系統（美國Applied Biosystems）進行實時熒光逆轉錄反應； 熱循環參數進行：16°C 30min，42°C 30min，在85°C 下放置5min，然后在4°C 下放置。 2-ΔΔCT 計算PECAM-1 表達水平，并標準化至GAPDH。

1.2.2 胎盤中PECAM-1 蛋白表達水平測定 如下對胎盤樣品中的PECAM-1 進行免疫組織化學分析。胎盤組織石蠟包埋并切成4μm 的厚度。將玻片在二甲苯中脫蠟兩次，持續10min，然后通過降低乙醇濃度將其重新水化。 在0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中于98°C 至100°C 的微波爐中進行10min 的抗原回收。 在室溫下，使用3%過氧化氫（在新鮮甲醇中） 封閉內源過氧化物酶活性10min 溫度。 用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌后，將切片與封閉血清溫育1h。 然后，將組織與兔PECAM-1 抗體（AF1086,1：40; R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）在4°C 孵育過夜。 作為二級抗體，使用辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗小鼠IgG （ 美國Dako Envision plus System，批 號：SD448596.36），用DAB 觀察陽性染色。兩名不知情的觀察員對結果進行評估。 PECAM-1 染色強度分級如下：0 表示無染色，1+弱染色，2+中度染色，3+強染色。 根據PECAM-1 陽性細胞的百分比對分布進行分級，然后如下劃分為四分位數：0，0～5%染色；1+，6～25%染色；2+，26～50%染色；3+，51～75%染色；4+，76～100%染色。 使用0～3 的評分標準（0：0～4%細胞染色；1：5～29%細胞染色；2：30-59%細胞染色；3：60～100%細胞染色測定免疫反應細胞百分比的估計值）。 染色強度評分為0～3（0，陰性；1，弱；2，中等；3，強）。 然后將數量和染色強度評分的值相乘，得到范圍為0 至9 的結果。

1.3 統計分析 應用SPSS23.0 對數據進行錄入、統計學分析。 計量資料以均數±標準差表示，采用t 檢驗比較，檢驗水準α 為0.05。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較 對照組和病例組年齡、BMI、身高、體重、妊娠周數等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 兩組糖脂代謝指標比較 與對照組比較，病例組TG、TC、LDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMAISI 水平升高，HOMA-β 水平降低（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組糖脂代謝指標比較

2.3 對照組和病例組中血清PECAM-1 mRNA、臍血PECAM-1 mRNA 表達比較 與對照組比較，病例組血清PECAM-1 mRNA、 臍血PECAM-1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。 見表3。

表3 對照組和病例組中血清PECAM- 1mRNA、臍血PECAM- 1 mRNA 水平比較

2.4 對照組、病例組中胎盤PECAM-1 蛋白表達評分比較 與對照組比較，病例組胎盤組織PECAM-1 蛋白表達陽性率、PECAM-1 蛋白表達評分降低（P＜0.05）。 見表4。

表4 對照組、病例組中PECAM- 1mRNA 水平比較

2.5 血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM-1 蛋白、臍血PECAM -1 mRNA 與各變量相關性 血清PECAM -1mRNA、 胎盤PECAM -1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA 與TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 負相關，與HOMA-β 正相關（P＜0.05）。 見表5。

表5 血清PECAM- 1mRNA、胎盤PECAM- 1 蛋白、臍血PECAM- 1 mRNA 與各變量相關性

2.6 妊娠發生糖尿病的多因素Logistic 回歸分析以妊娠婦女是否發生糖尿病為應變量（是=1，否=0），各血清指標為自變量進行多因素logistic 逐步回歸分析，結果發現：血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM -1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均為妊娠婦女發生糖尿病的危險因素（P＜0.05）。 見表6。

表6 妊娠孕婦出現糖尿病的多因素Logistic 回歸分析

圖1 PECAM- 1 在對照組、病例組胎盤組織的表達

3 討論

越來越多的證據表明，炎癥分子的系統性和局部產生可能對導致GDM 中的IR 至關重要，包括CRP、TNF-α 和IL-6。 PECAM-1 是抑炎反應的候選者。 PECAM-1 在受到LPS 和有害代謝產物的刺激后，它將螯合下游分子MyD88，阻止轉錄因子NF-kB 向核轉移，并抑制促炎性細胞因子和趨化因子的產生，包括IL-6、TNF-α、趨化因子（CC 基序）配體2（CCL2），這些細胞因子都將在IR 中起決定作用[10]。 先前對IR 的研究集中在肝臟、脂肪組織或骨骼肌。 本研究將重點放在胎盤上，并輔助檢測臍血、血清PECAM-1 表達水平。 胎盤作為母胎界面執行各種功能的載體，在GDM 的發展和進程中發揮關鍵作用。 胎盤來源的激素，人胎盤乳原（hPL）和人胎盤生長激素（hPGH）被認為是重編程產婦生理學以實現胰島素抵抗狀態的主要因素。此外，GDM 婦女胎盤中炎癥途徑的上調基因以及脂質，氨基酸和葡萄糖轉運的基因，也在全身或局部IR 中起作用。

PECAM-1 及其各種共受體和必需蛋白（包括CD14）的表達改變已在人胎盤中描述，并且在妊娠并發癥中也有所改變。 在絨毛膜羊膜炎（CAM）早產的胎盤中絨毛狀Hofbauer 細胞中的PECAM-1表達低于沒有CAM 的早產胎盤，或有或沒有CAM的足月胎盤；較低水平的PECAM-1 水平發生在妊娠并發先兆子癇的胎盤中[11]。 與上述的研究一致，與對照組比較，病例組胎盤組織PECAM-1 蛋白表達陽性率、PECAM-1 蛋白表達評分降低（P＜0.05）。本研究在GDM 胎盤的各種細胞中觀察到了PECAM-1 的表達，包括合體滋養層細胞，內皮細胞，蛻膜細胞和羊膜上皮細胞，且合胞體滋養層和成纖維細胞染色最弱。 研究表明PECAM-1 的表達可能與胎盤部位有關，本研究發現，PECAM-1在胎盤與母體接觸部位表達最弱，這可能歸因于胎盤的母體部分與母體有更多的血液交流，而大量刺激性物質的母血可以抑制PECAM-1。 除微生物外，組織損傷的內源性信號也可以抑制PECAM-1，其中包括來自凋亡，損傷相關分子模式的碎片，ECM 降解產物，高遷移率box-1 蛋白（HMGB1），脂肪酸，熱激蛋白，AGEs 在組織損傷和發炎時釋放[12，13]。 本研究同時也檢測了，血清臍帶血中PECAM-1 水平，結果顯示，與對照組比較，病例組血清、 臍血PECAM-1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。 這與胎盤研究結果一致。

近期研究表明,糖脂代謝異常和游離飽和脂肪酸的積累也可能在胎盤PECAM-1 途徑的抑制中具有潛在作用。 對肝細胞、脂肪組織和骨骼肌的研究表明，PECAM-1 在局部胰島素敏感性中起重要作用[14]。 在GDM 的胎盤中已經檢測到胰島素信號傳導受損。 胎盤是胰島素受體的豐富來源，也是妊娠中胰島素的靶組織[15]。 胰島素的受體水平可通過周圍的胰島素濃度來調節[16-18]。 研究表明,在GDM中，總胎盤和滋養細胞膜中的胰島素受體蛋白發生了變化，且PECAM-1 與胰島素受體蛋白相關性明顯。 本研究檢測血糖脂水平，結果顯示： 血清PECAM-1 mRNA、 胎盤PECAM-1 蛋白、 臍血PECAM -1 mRNA 與TG、TC、LDL -C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-ISI 負相關，與HOMA-β 正相關（P＜0.05）。 這表明，PECAM-1 與GDM 的脂質代謝紊亂以及IR 相關。 本研究也探討了妊娠婦女發生糖尿病的相關因素，結果發現：血清PECAM-1 mRNA、胎盤PECAM-1 蛋白、臍血PECAM-1 mRNA、FBG、FINS、TC、HOMA-IR 均為妊娠婦女發生糖尿病的相關因素（P＜0.05）。 這提示血清、胎盤、臍血PECAM-1 為妊娠婦女發生糖尿病的危險因素，可作為GDM 的治療靶點。 由于大多數GDM 患者一旦被診斷出就接受了干預，包括飲食管理、運動甚至胰島素治療，這些治療對PECAM-1 表達的影響尚不清楚，這將在后續研究中探討。

綜上所述，妊娠期糖尿病患者血清、胎盤組織及臍血中PECAM-1 表達水平降低；PECAM-1 為妊娠婦女發生糖尿病的相關因素。