酒花內生菌Pseudomonas oryzihabitans F0-1轉化檸檬烯生成α-萜品醇的研究

廉長盛，付冬梅，張俊鵬，張逸凡，薛兆茹，王 越

（大連工業大學生物催化技術國家與地方聯合工程實驗室，遼寧 大連 116034）

檸檬烯又名苧烯，是一種重要的功能性單萜，已被發現存在于300 多種植物中。檸檬烯是柑橘類水果加工的副產物，在橙皮精油中含量高達90%～95%。因其價廉易得，且化學性質活潑，被用作合成萜烯衍生物的前體，這些衍生物在食品、醫藥和精細化工行業中應用廣泛[1-2]。

檸檬烯可以轉化為含氧單萜化合物，相比于萜烯類化合物，含氧單萜具有更強的香氣，且自然資源中含量少。如α-萜品醇，它是一種單萜類化合物，其在香料行業中的商業價值較高，消耗量約為每年9.2 t。α-萜品醇具有紫丁香的花香氣味，在香水、化妝品和洗漱用品中通常用作香料[3-4]。由于其抗菌和抗氧化特性，在制藥工業中也被用作抗真菌劑和消毒劑產品[3,5-6]，并在食品工業中用作防腐劑，可用于調配檸檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精[7-9]。

研究發現，真菌和細菌能在有氧條件下對檸檬烯進行生物轉化。Tai 等[10]利用Penicillium sp 轉化檸檬烯，產物主要是α-萜品醇和少量的香芹酮和香芹醇；Rottava 等[11]從400 種微生物中篩選出能轉化檸檬烯生成α-萜品醇的黑曲霉；Bicas 等[12]通過熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens 轉化檸檬烯生成α-萜品醇。相比化學合成，微生物轉化反應因操作簡單、條件溫和、高效率和高選擇性、無毒、對環境友好，顯示出廣闊的基礎理論研究和應用前景[13]。目前天然來源的化合物比化學合成的化合物具有更高的市場價值，因此，通過生物轉化獲得天然香料具有很高的市場研發價值[14-15]。

啤酒花是大麻科葎草屬多年生攀援草本植物，是一種重要的香料和藥用植物[16-18]，其揮發成分酒花油中含有70%的萜烯化合物，包括單體萜烯如α-蒎烯和香葉烯，倍半萜烯如β-石竹烯和α-葎草烯等[19]。而酒花內生菌長期伴隨植物生長，參與宿主的生長代謝，很可能會具備與宿主植株相似次生代謝的潛能[20-21]。因此，開發植物內生菌資源，將會為天然產物的合成提供新方案。本研究從酒花內生菌入手，篩選具有檸檬烯轉化潛力的菌種，進行生理生化和分子鑒定，并優化生物轉化條件，以提高酒花內生菌轉化檸檬烯的轉化率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

野生新鮮酒花雌花果，摘自河北省秦皇島；α-萜品醇標準品（＞99%），內標物萜品烯-4-醇（＞99%），阿拉丁試劑有限公司；檸檬烯（＞95%），北京百靈威科技有限公司；次氯酸鈉，乙酸乙酯（≥95%），乙醇（≥95%），甲醇（≥95%）和甘油（≥95%），科密歐化學試劑有限公司；瓊脂粉、胰蛋白胨、大豆粉和植物蛋白胨，北京奧博星生物技術有限公司；NaCl、K2HPO4等分析純，天津市大茂化學試劑廠；甘露醇，沈陽市試劑二廠。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 分離培養基

水瓊脂培養基（WA）：瓊脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

酵母提取物瓊脂培養基（TWYE）：酵母提取物0.25 g/L，K2HPO40.5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.2±0.2。

甘露醇大豆瓊脂培養基（MS）：甘露醇20 g/L，大豆粉20 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.2±0.2。

大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）：胰蛋白胨15 g/L，植物蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH 7.3±0.2。

1.1.2.2 復篩培養基

甲醇0.1 g/L，(R)-(+)-檸檬烯4.5 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L和瓊脂20 g/L。

1.1.2.3 LB 培養基

胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L。

1.1.2.4 細菌基本培養基

葡萄糖5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L。

1.1.2.5 營養培養基（NA）

牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

1.1.3 儀器與設備

GC9790Plus 氣相色譜儀，浙江福立分析儀器股份有限公司；7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀，配EI 離子源，美國Agilent 公司；DB-FFAP 毛細管色譜柱，中科院大連化物所；SPME 專用磁力加熱攪拌器，SPME-GC PK 1 固相微萃取手柄，北京康林科技有限責任公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）萃取頭，美國Supelco 公司；ZQZY78CNT 型振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選及鑒定

1.2.1.1 菌種的篩選

先將新鮮酒花用流水沖洗，晾干，分別剪成根、莖、葉、花等部分。用75%酒精浸泡3 min，無菌水沖洗3次；用10%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗3 次。在無菌條件下，分別將消毒處理的酒花花莖、花軸、苞葉和花朵（包含蛇麻腺）部位切成1 cm×1 cm 的小塊，均勻置于分離培養基上，37 ℃培養。

將4 種分離培養基分離獲得的菌株轉接至LB瓊脂培養基，培養24 h，劃線純化菌株。采用感官評定法對產香內生細菌進行聞香篩選。

將菌株經過液體LB 培養基活化，按照5%接種量接入到復篩培養基中（250 mL 具塞磨口瓶），30 ℃，200 r/min 條件下恒溫振蕩培養。轉化72 h，利用固相微萃取-氣相色譜-質譜連用（SPME-GC-MS）檢測轉化產物。

1.2.1.2 菌種的鑒定

形態學特征初步鑒定：對菌落形態特征、顏色、大小、革蘭氏染色等進行觀察。生理生化試驗鑒定參照文獻[22]。

分子生物學鑒定：提取篩選菌株的DNA 進行16S rDNA PCR 擴增。利用16S rDNA 的1492R 和27F通用引物進行PCR 擴增。測序由吉林省庫美生物技術有限公司完成。測序結果在GenBank 數據庫系統中進行基本局部比對，采用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.2 萜烯物質SPME-GC-MS 分析方法

固相萃取條件：將發酵液在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心10 min，吸取5 mL 上清液移入固相萃取樣品瓶中。加入2 g NaCl 促進樣品揮發，將樣品瓶放在固相萃取儀上，溫度60 ℃，轉速160 r/min。推出SPME 萃取頭的纖維，吸附30 min 后，插入GC 進樣口解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-FFAP 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm），載氣為氮氣；升溫程序為：柱初溫45 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min。分流比為5∶1。

質譜條件：離子源溫度220 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描范圍（m/z）100～420。

定量分析：采用內標法進行定量，α-萜品醇標準曲線如下：

y=0.635 6x+0.201 2，R2=0.997 4

式中：x 為α-萜品醇與內標濃度比；y 為α-萜品醇與內標面積比。

1.2.3 生長時期及轉化時間的篩選

為了考察細菌培養基對Pseudomonasoryzihabitans F0-1 菌株在不同生長期轉化檸檬烯生成α-萜品醇的影響，將菌株分別接種到NA 培養基和細菌基本培養基中，定時測定菌液在波長為600 nm 下的光密度值，以OD 值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制菌株在NA 和細菌基本培養基中的生長曲線。

根據測得的生長曲線，在30 ℃，200 r/min 轉化培養基中培養內生菌F0-1，分別在各生長時期加入檸檬烯，定時取樣。按照“1.2.2”中的方法檢測α-萜品醇濃度，考察不同生長時期及轉化時間對內生菌F0-1轉化檸檬烯生成α-萜品醇的影響。

1.2.4 共溶劑種類的篩選

為考察共溶劑對F0-1 菌生物轉化的影響，分別配制20%的(R)-(+)-檸檬烯/共溶劑混合溶液。將混合溶液添加到在NA 培養基中培養38 h 的F0-1 菌液內，培養條件為30 ℃，200 r/min，共溶劑分別為乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甘油。轉化12 h，檢測α-萜品醇濃度，對照為不加共溶劑。

1.2.5 底物濃度的篩選

為了考察F0-1 轉化檸檬烯的最適濃度，將F0-1菌培養24 h 后，分別加入440、880、1 760、3 520 mg/L R-(+)-檸檬烯，生物轉化12 h 后，測定α-萜品醇濃度，篩選適宜的底物濃度。

1.2.6 轉化條件的篩選

1.2.6.1 轉化溫度

為考察溫度對F0-1 轉化的影響，采用不同轉化溫度（10、20、30、40 ℃），菌種在200 r/min 預培養38 h后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液，轉化12 h 后，檢測α-萜品醇濃度，篩選適宜的轉化溫度。

1.2.6.2 pH

為考察轉化體系中pH 值對F0-1 轉化檸檬烯生成α-萜品醇的影響，用0.05 mol/L 的檸檬酸磷酸緩沖液調節轉化培養基pH 為3.0～8.0。菌種在30 ℃，200 r/min 預培養38 h 后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液，轉化12 h 后，檢測α-萜品醇濃度，篩選適宜的pH。

1.2.6.3 轉速

為考察轉速對生物轉化的影響，將F0-1 菌種在30 ℃，200 r/min，pH 6.0 條件下預培養38 h 后，加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液。分別采用0、100、200、300 r/min 進行轉化，轉化12 h 后，檢測α-萜品醇濃度，確定最佳的轉速。

1.2.7 數據處理

使用Execl 軟件處理數據，使用MEGA 7.0 構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選及鑒定

2.1.1 酒花內生菌的篩選

將消毒處理過的酒花的花莖、花軸、苞葉和花朵（包含蛇麻腺）部位分別在4 種分離培養基（WA、TWYE、MS、TSA）中恒溫培養，共分離出22 株產香內生細菌，其中通過WA 培養基分離出2 株細菌；通過TWYE 培養基分離出14 株細菌；通過MS 培養基分離出6 株細菌；通過TSA 培養基沒有分離出微生物。

經過復篩培養基篩選和SPME-GC-MS 分析，F0-1和F0-2 兩株菌均可以轉化檸檬烯生成含氧單萜化合物。菌種F0-1 能轉化檸檬烯生成香芹酮、香芹醇和α-萜品醇，生成的α-萜品醇濃度為（9.24±1.67）mg/L。菌種F0-2 能轉化檸檬烯生成香芹酮和α-萜品醇，生成的α-萜品醇濃度為（2.04±1.11）mg/L。兩種菌都能轉化檸檬烯生成α-萜品醇，且F0-1 菌生成的α-萜品醇濃度是F0-2 菌的4.5 倍，因此選定F0-1 為轉化檸檬烯合成α-萜品醇的菌株，并對F0-1 進行菌種鑒定。

2.1.2 內生菌F0-1 菌種的鑒定

細菌在LB 培養基37 ℃下培養24 h 后觀察菌落的形態，可以看到菌落黃色，圓形，凸起，干燥皺起，邊緣整齊。顯微鏡下觀察革蘭氏染色結果為陰性，F0-1菌生理生化結果見表1，系統發育樹見圖1。

表1 F0-1 菌生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of F0-1 strain

圖1 內生菌F0-1 的16S rDNA 系統發育樹Fig.1 16S rDNA system development tree of F0-1 bacteria strain

F0-1 與NCBI 核酸數據庫進行同源性菌的16S rRNA 基因序列比對，與Pseudomonas oryzihabitans 相似性達99.99%。結合菌株F0-1 的生理生化結果、菌落形態特征及16S rDNA 分析，鑒定菌株F0-1 為棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。

2.2 不同生長時期及轉化時間對α-萜品醇產量的影響

培養基的營養成分和濃度對微生物生長和轉化檸檬烯合成α-萜品醇有不同影響[23]。由圖2 可知，F0-1 在細菌基本培養基中進入對數生長期、穩定期和衰亡期的時間分別是6 h、22 h 和46 h；在NA 培養基中F0-1 的生長周期更短一些，進入對數生長期、穩定期和衰亡期的時間分別是2 h、10 h 和38 h。

圖2 F0-1 菌在兩種培養基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of F0-1 bacteria strain in two culture media

由圖3 可見，兩種培養基都是在衰亡期合成α-萜品醇濃度高于對數期和穩定期，且NA 培養基產量更高，在衰亡期轉化12 h 合成α-萜品醇最高，為38.7 mg/L；細菌基本培養基中的最高產量在衰亡期轉化24 h 處獲得，為28.6 mg/L。臺亞楠[24]在優化指狀青霉DSM 62840 轉化檸檬烯條件時，發現對數期添加檸檬烯能獲得最大產量。菌種不同，最適底物添加時期也不同，細菌Pseudomonas gladioli 和指狀青霉不同，其最適底物添加時期為對數晚期至穩定期，此時的菌量較高[25]。而F0-1 菌衰亡期α-萜品醇生成量高的原因可能是由于這時體系中碳源消耗過大，此時添加檸檬烯作為新的碳源，被菌種利用。也可能是細胞衰亡裂解，胞內的酶更容易和底物接觸。對比兩種培養基，NA 培養基的轉化量較高，且最高轉化量在添加底物后的12 h，轉化時間短，效率高。因此，最優條件為將F0-1 菌接種到NA 培養基中，在衰亡期（培養38 h）添加檸檬烯，轉化12 h。

圖3 不同生長時期及轉化時間對α-萜品醇產量的影響Fig.3 Effects of different growth stages and conversion time on the α-terpineol production

2.3 共溶劑種類對檸檬烯生物轉化的影響

檸檬烯難溶于水相，溶解度僅為0.015 mmol/L，化學穩定性差，易發生自動氧化[26]。用共溶劑可以增加檸檬烯的溶解度，從而提高產物濃度[27]。由圖4 可知，共溶劑促進作用從大到小依次為乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞甘油。添加乙醇為共溶劑，α-萜品醇濃度比對照組提高48.5%，極性有機溶劑可以提高檸檬烯等萜烯物質的溶解度，在生物轉化中形成單向系統，加快反應速度，一般會促進產物生成[28]。因此甲醇和乙醇對生物轉化均有促進作用；與空白對照相比，甘油使α-萜品醇濃度降低3.14 mg/L，在4 種共溶劑中，甘油對F0-1 的生物轉化影響并不顯著。非極性有機溶劑乙酸乙酯對生物轉化也有一定的促進作用，α-萜品醇濃度提高了9.1%。考慮到乙醇價格低，可用于食品添加劑的萃取，且對檸檬烯生物轉化的促進作用明顯，因此選擇乙醇作為生物轉化的共溶劑。

圖4 共溶劑對檸檬烯生物轉化的影響Fig.4 Effects of cosolvent on biotransformation of limonene

2.4 底物濃度對萜品醇產量的影響

研究表明，高濃度的萜烯物質對微生物細胞有毒害作用[29]，這也是微生物轉化單萜生成含氧衍生物的難點之一，單萜濃度過高會影響微生物轉化能力并抑制微生物的生長[28]。由圖5 可知，檸檬烯轉化的最適濃度為880 mg/L，當高于880 mg/L 時，產量下降。Gloria等[23]用指狀青霉DSM62840 轉化檸檬烯時，當檸檬烯濃度過高時會影響轉化的選擇性，生成其他含氧衍生物。因此，選擇880 mg/L 的檸檬烯作為F0-1 轉化的最適濃度。

圖5 檸檬烯濃度對α-萜品醇產量的影響Fig.5 Effects of limonene concentrations on the α-terpineol production

2.5 轉化條件對α-萜品醇合成的影響

2.5.1 溫度對α-萜品醇產量的影響

檸檬烯生物轉化效率與溫度相關[25]。由圖6 可知，培養溫度對α-萜品醇產量有較大的影響，30 ℃時產量最高。從10～30 ℃，轉化量逐漸上升，轉化溫度40 ℃時產量大幅下降，可能是高溫影響了轉化酶活力，并且高溫也不適合微生物生長。

圖6 培養溫度對α-萜品醇產量的影響Fig.6 Effects of culture temperatures on the α-terpineol production

2.5.2 pH 對α-萜品醇產量的影響

由于在pH 為3.0 和4.0 時，F0-1 菌無法生長，故不在圖7 中體現。由圖7 可見，pH 為6.0 時α-萜品醇產量最高。當pH 大于7.0 時，α-萜品醇濃度下降。有研究報道，pH 大于3.5 時，檸檬烯產生分子內重排，通過不同碳原子的羥基化反應、異構化反應、氧化反應和斷裂循環，促進了檸檬烯含氧化合物的形成[23]。pH 大于7.0 時，α-萜品醇濃度降低，原因可能是堿性條件下的α-萜品醇性質不穩定。Bicas 等[30]報道尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum 152b 在pH 5.2～8.2 之間生物轉化檸檬烯生成α-萜品醇；Gloria 等[23]報道指狀青霉Penicillium digitatum DSM 62840 轉化檸檬烯的最適pH 為3.5，此pH 下α-萜品醇產量最大。Tan 等[31]的研究也發現Penicillium digitatum NRRL 1202 在酸性環境下更利于生物轉化，在pH 4.0 時產量最高。與這些真菌略有不同，P.oryzihabitans F0-1 在pH 小于5 時無法轉化，在6.0～7.0 的微酸性反應體系中轉化檸檬烯合成α-萜品醇的產量最高。

圖7 體系pH 對α-萜品醇產量影響Fig.7 Effects of system pH values on the α-terpineol production

2.5.3 轉速對α-萜品醇產量的影響

萜烯生物轉化為含氧衍生物是需氧的[32]，溶氧量對產物轉化量影響較大，振蕩培養可以提高體系的溶氧量[33]。在假絲酵母Candida maltosa 生物轉化過程中，其關鍵酶NADPH-cytochrome P-450 和cytochrome P-450 單加氧酶在60 r/min 時的轉化效率更高[34]。圖8 顯示在轉速為200 r/min 時，α-萜品醇的產量最高，達到97.54 mg/L，當體系靜止或處于過高轉速時都不利于生成產物，因此選用中等轉速200 r/min 作為生物轉化培養條件。

圖8 轉速對α-萜品醇合成的影響Fig.8 Effects of rotational speeds on the α-terpineol production

3 結論

從新鮮酒花中篩選出能轉化(R)-(+)-檸檬烯合成α-萜品醇的內生菌F0-1。對該菌株進行生理生化和分子生物學鑒定，為棲稻假單胞菌Pseudomonas oryzihabitans。并對F0-1 菌生物轉化的條件進行了優化，F0-1 菌在30 ℃，體系pH 為6.0，轉速200 r/min的NA 培養基中預培養38 h，添加20%的檸檬烯/乙醇溶液，檸檬烯濃度為880 mg/L，轉化12 h，得到的α-萜品醇濃度為（97.54±3.34）mg/L，是最初轉化結果（9.24±1.67）mg/L 的10.6 倍。