秦皮中香豆素提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

童天嬌，劉 偉，胥鑫萌，李恒睿，劉軍海

（陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

近年來國內(nèi)外學(xué)者在對(duì)秦皮的大量研究中發(fā)現(xiàn)，秦皮具有極高的臨床藥用價(jià)值[1-2]，秦皮的主要化學(xué)成分是香豆素[3]。白芷[4]、北沙參[5]等植物中都含有香豆素類成分，其多以糖類化合物的形式存在于植物器官中，如花、嫩葉、果實(shí)等，此外，在某些真菌中也發(fā)現(xiàn)有香豆素類成分存在[6]。香豆素類成分的生物活性極高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)香豆素類成分對(duì)于多種人類頑疾[7]具有治療功效，且存在進(jìn)一步的研究價(jià)值。醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)香豆素對(duì)腫瘤、過敏、發(fā)炎具有一定的治療效果[8-13]，香豆素還是一種天然抗氧化劑[14]，可延緩人體的衰老，增強(qiáng)自身抵抗力。大量研究從生物化學(xué)分子構(gòu)成上闡述了天然香豆素的藥理功效，天然香豆素的母核不同位置的不同取代基對(duì)于其生物活性的影響起決定性作用[15]。秦皮甲素屬于香豆素類化合物，因此本文以秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品[16]來研究提取總香豆素的含量。借助超聲波輔助法提取秦皮中香豆素，并對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化性研究，以期為秦皮中香豆素的提取、開發(fā)以及綜合利用提供理論參考和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

秦皮，購自藥材店，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，無水乙醇（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%）；秦皮甲素對(duì)照品（分析標(biāo)準(zhǔn)級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），酷爾生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FW100 型高速萬能粉碎機(jī)、WGLL-230BE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BSA2245-CW型電子天平，維多利斯科學(xué)儀器（北京）公司；JP-010型數(shù)控超聲波清洗器，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；722G 型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC-2030 型液相色譜儀，島津企業(yè)管理有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

精確稱取秦皮粉末1.00 g，將其置于燒杯中，將乙醇作為提取溶劑，固定超聲功率100 W；超聲溫度50 ℃；超聲時(shí)間50 min；提取次數(shù)為3 次，用200 目紗篩進(jìn)行過濾，將濾液趁熱減壓抽濾，最后用乙醇定容于100 mL 容量瓶中，測(cè)定香豆素的含量并計(jì)算得率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 表面活性劑用量的篩選

分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%（0.01 g）、3%（0.03 g）、5%（0.05g）、7%（0.07g）的表面活性劑十二烷基硫酸鈉，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度的篩選

加入的乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.3 提取溫度的篩選

分別設(shè)定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間的篩選

分別設(shè)定提取時(shí)間為20、30、40、50、60 min，按“1.2.1”中的條件提取，研究不同提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

1.2.2.5 料液比的篩選

用60%乙醇進(jìn)行提取，設(shè)置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），按“1.2.1”中的條件提取，研究不同料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取時(shí)間、提取溫度、溶劑濃度、料液比為主要影響因素，以香豆素得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels table

1.2.4 香豆素得率的測(cè)定

用電子天平稱取秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品8 mg，用無水乙醇溶解定容至100 mL 的容量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后分別量取2.5、5、7.5、10、12.5、15 mL，用無水乙醇定容到50 mL 的容量瓶中，搖勻后靜置，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液∶甲醇＝1∶9 進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長：334nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃，流速：0.6 mL/min，保留時(shí)間約為3 min，測(cè)定香豆素色譜峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到峰面積（Y）與香豆素質(zhì)量濃度X（μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝39 564.45 X-19 828.13，其中R2＝0.999 53。按照香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定樣品色譜峰面積，按下式計(jì)算香豆素得率。

式中：c 為香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的提取液濃度（mg/mL）；v 為樣品溶液體積（mL）；n 為稀釋倍數(shù)；m為秦皮粉末質(zhì)量（mg）。

1.2.5 抗氧化性試驗(yàn)

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參照謝佳函等[17]的方法，稍作修改。精密稱取DPPH 2.5 mg，用無水乙醇定容到100 mL 容量瓶中，取7支10mL 具塞試管，分別量取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL 濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液，分別加入2 mL 的DPPH 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光放置），搖勻后靜置30 min，用可見分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值為A，波長調(diào)至517nm，以無水乙醇加DPPH 溶液為空白對(duì)照，記為A0；待測(cè)樣品和無水乙醇加DPPH 溶液的混合液為空白，記為B。空白對(duì)照中DPPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液的濃度一致。VC 作為對(duì)照組。按下式計(jì)算清除率。

1.2.5.2 羥自由基清除率的測(cè)定

參照薛天樂[18]的方法，稍作修改。取7 支20 mL具塞試管依次加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，分別量取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液于試管中，加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液、3.5 mL 蒸餾水，最后再加入5.0 mL 濃度為88 mmol/L 的雙氧水，搖勻，靜置15 min。待溶液反應(yīng)完全，于510 nm 處測(cè)定吸光度A，參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替雙氧水溶液測(cè)得的吸光度為B，參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替秦皮中香豆素提取液所測(cè)得的吸光度為A0，參比為蒸餾水。空白對(duì)照中DPPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液濃度一致。VC 作為對(duì)照組。按“1.2.5.1”中公式計(jì)算清除率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響

由圖1 可知，隨表面活性劑的增加，秦皮中香豆素得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，得率達(dá)到最大，這可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┧赜械碾p親分子結(jié)構(gòu)在香豆素提取過程中使表面張力降低，更容易讓乙醇滲入到香豆素中，內(nèi)擴(kuò)散速度加快。綜上考慮，表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%較為適宜。

圖1 表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.1 Effects of surfactants additions on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.2 乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增大，得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，香豆素得率達(dá)到最高點(diǎn)，這可能是因?yàn)?0%乙醇濃度的極性與香豆素的極性非常接近。所以，選擇60%的乙醇濃度較為適宜。

圖2 乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrations on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.3 提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響

由圖3 可知，隨著溫度升高，得率先上升后下降，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，得率達(dá)到最高點(diǎn)，而超過50 ℃開始下降。可能是因?yàn)闇囟冗^高，當(dāng)接近或達(dá)到沸點(diǎn)時(shí)，乙醇揮發(fā)變快，浸出過程難以穩(wěn)定，從而造成得率降低。另外，高溫條件下可能有更多的雜質(zhì)溶出，因此綜合考慮，選取50 ℃為較適宜的提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響

由圖4 可知，隨著提取時(shí)間的延長，得率先上升后下降，提取時(shí)間為50 min 時(shí)得率最高，之后得率下降，這可能是因?yàn)槌暡ň哂袡C(jī)械剪切作用，長時(shí)間作用破壞了香豆素的結(jié)構(gòu)，使得后續(xù)處理過程中秦皮香豆素?fù)p失而影響得率。因此，選擇提取時(shí)間為50 min 較為適宜。

圖4 提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.1.5 料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響

由圖5 可知，在料液比（g/mL）為1∶5～1∶10 范圍內(nèi)，秦皮香豆素得率呈上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楫?dāng)秦皮質(zhì)量一定時(shí)，溶劑用量越大，它的體系滲透壓就越大，香豆素越容易提取出來。但繼續(xù)增大溶劑用量，得率趨于下降，這是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑用量增大到一定程度后，隨著提取的進(jìn)行，滲透壓變化減小，滲透壓的改變對(duì)香豆素提取不再有明顯的作用，當(dāng)溶劑用量過大時(shí)，增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度開始下降，故降低了有效成分的提取。因此，綜合考慮，選取料液比1∶10（g/mL）較為適宜。

圖5 料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratios on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，秦皮中香豆素提取的最佳工藝條件為A2B1C1D2，即提取時(shí)間40 min、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%、料液比為1∶10（g/mL）。按此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，取平均值，得到秦皮中香豆素得率為1.038%。由表3 可知，4 種因素對(duì)得率的影響均不顯著。

表2 超聲輔助提取秦皮香豆素L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction of coumarin from cortex fraxini

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.3 香豆素抗氧化性研究結(jié)果

2.3.1 香豆素提取液對(duì)DPPH 自由基的清除能力

由圖6 可知，香豆素提取液對(duì)DPPH 自由基有較好的清除能力，隨著濃度的升高清除能力逐漸增強(qiáng)，且顯著高于對(duì)照組VC 的清除率（P＜0.05），當(dāng)溶液體積為3 mL 以后清除作用逐漸平穩(wěn)。香豆素提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基都具有良好的清除能力，表明香豆素具有很好的抗氧化作用，相同濃度下對(duì)DPPH 自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

圖6 香豆素提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of coumarin extract and VC on DPPH free radicals

2.3.2 香豆素提取液對(duì)羥自由基的清除能力

由圖7 可知，香豆素提取液對(duì)羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力，并且隨著樣品濃度升高其對(duì)羥自由基的清除作用加強(qiáng)。當(dāng)溶液體積增至2.5 mL 以后，VC 清除率趨于穩(wěn)定，香豆素提取液在3 mL 以后清除率趨于平穩(wěn)，且在相同濃度下，樣品溶液羥自由基清除能力均顯著高于VC 溶液（P＜0.05），說明香豆素提取液抗氧化活性高于VC 溶液。

圖7 香豆素提取液和VC 對(duì)羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of coumarin extract and VC on hydroxyl radicals

3 結(jié)論

本文采用表面活性劑強(qiáng)化技術(shù)，通過超聲波輔助提取秦皮中香豆素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。得到秦皮中香豆素的最佳提取工藝條件為：表面活性劑用量3%，提取時(shí)間40 min，提取溫度60 ℃，乙醇濃度50%，料液比1∶10（g/mL），平均得率為1.038%。抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，秦皮中香豆素具有很好的抗氧化作用，相同濃度下樣品溶液對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

本文選取十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑，對(duì)秦皮香豆素提取有強(qiáng)化作用，且成本較低，具有較好的發(fā)展前景，可為香豆素的提取以及秦皮的開發(fā)提供積極的參考價(jià)值。