曲唑酮對青春期雄性大鼠神經行為的影響及其相關機制研究

曲唑酮（trazodone）是一類經過FDA批準的抗抑郁癥藥物，屬于5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受體拮抗劑和再攝取抑制劑，可拮抗5-HT的Ⅱ型受體，還可發揮抗膽堿作用

。另有研究發現，曲唑酮除了具有抗抑郁活性，其對失眠、焦慮、創傷后應激障礙（PTSD）和強迫癥等多種精神疾病具有治療效果

。由于抑郁、失眠、焦慮等疾病均會影響患者的認知功能

，對患者的日常生活和工作等造成困擾，因此需要對抑郁等疾病中認知功能發生改變的原因進行探索并尋找解決方案。5-HT是腦內一種重要的神經遞質，若5-HT水平降低，神經元間的信息交流會出現延緩，其水平減少直接與精神、情緒、行為變化有關；MAPK蛋白與神經障礙密切相關，ERK1/2及p38MAPK是MAPK家族蛋白，ERK1/2可通過突觸調節神經元重塑及可塑性，p38MAPK在應激下被激活，對神經可塑性及中樞神經系統發育具有重要作用

；c-fos基因表達是神經元激活的標志，其可作為情感、神經損害、行為改變的一個重要標志，5-HT可通過刺激神經元MAPK蛋白、c-fos基因來影響腦部神經功能

，因此我們推測5-HT受體拮抗劑曲唑酮可能對青春期雄性大鼠認知功能產生影響，同時選擇MAPKERKP38、c-fos基因表達作為觀察指標，分析曲唑酮的作用機制，從而為臨床上曲唑酮在神經行為中的應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠32只，7～8周齡，體質量280～320 g，購自南京模式動物生物有限公司，均飼養于動物房鼠籠，12 h/12 h明暗交替循環，溫度20～22 ℃，濕度50%～55%。

1.2 動物分組 將大鼠按照隨機數字表分為4組：對照組、曲唑酮低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組8只。用生理鹽水配制曲唑酮溶液，低、中、高組依次給予10 mg/kg、20 mg/kg和50 mg/kg曲唑酮溶液腹腔注射，對照組腹腔注射等量生理鹽水，連續14 d。

公共藝術作為公共空間中的藝術形態，不僅以重要的人文景觀，起著協調環境、發揮公共空間親和力和審美趣味提升的作用，還以一種特殊的形式提醒大眾合理處理人與自然的正常而和諧的關系，在人與自然環境之間建立一種平衡。當然，科學發展觀指導下的科學和技術，在合理利用、開發和保護自然方面發揮著主導的作用，但是，藝術在修復人與自然的關系、創造人與自然的新關系方面也有著不可忽視的力量。藝術家在開放的、較大空間區域里，通過對空間的重新構架、特殊材質運用、造型與色彩的奇妙組合、AR HR等新媒體的應用，等一系列藝術創作手段，創造出人與自然和諧關系的公共藝術作品，警示自然環境對人類生存與發展的重要性。

1.3 曠場實驗

連續注射曲唑酮14 d后進行曠場實驗，實驗所采用的曠場箱大小為100 cm×100 cm×40 cm，用黑線將底面劃分成25個小正方格，每個正方格為20 cm×20 cm。將周邊的16個正方格記為外周格，位于中央的9個正方格稱為中央格。在正中央方格上方安置高像素攝像頭。實驗在安靜的環境下進行。將大鼠放入場地中央自由活動10 min，為預適應階段。測試階段：將大鼠面朝墻放入同一個拐角方格，并讓其自由探索環境5 min，同時進行攝像和計時。結束后清洗方箱內壁及底面，以免上次動物余留的信息（動物的大、小便、氣味）影響下次測試結果。更換動物，繼續實驗。分析每只大鼠在曠場中的總路程和進入中央格的次數、在中央格的停留時間。

1.4 強迫游泳實驗

曠場實驗結束后進行強迫游泳實驗，于正式實驗前24 h將測試大鼠放入裝有25 ℃水的透明玻璃缸（1.5 m×1 m×0.5 m）中，室溫25 ℃，大鼠懸浮四肢不能觸及桶底，15 min后將大鼠取出、擦干后放回籠中；次日在同樣的條件下進行強迫游泳5 min，記錄5 min內大鼠靜止不動時間（大鼠僅有頭部露出水面，身體飄浮在水中，四肢可有微動但不掙扎），測試過程采用攝影機記錄，采用荷蘭Noduls公司強迫游泳分析軟件分析數據。

曲唑酮是第二代抗抑郁藥物，一般認為它與傳統的抗抑郁藥物不同，因為曲唑酮基本對單胺類遞質的氧化性不產生影響，對去甲腎上腺素再攝取過程的作用也微乎其微

。而曲唑酮對于5-HT能神經元系統的作用也較為復雜。在體內外實驗中，曲唑酮被發現可以選擇性抑制5-HT轉運體，但是它抑制5-HT轉運體的能力相比選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRIs）較弱，只有持續給予曲唑酮處理才可以達到SSRIs的抑制效果

。曲唑酮劑量的選擇是因為其常規劑量為10 mg/kg，而孟德軒等研究發現大劑量20 mg/kg曲唑酮對腦卒后抑郁大鼠的空間學習及記憶功能的影響最佳

，本文以20 mg/kg作為中劑量，以50 mg/kg作為大劑量進行了分析，以判斷是否增加曲唑酮劑量仍可增加青春期雄性大鼠神經行為的影響效果。

染色前將玻片晾干，0.5% Triton溶液室溫破膜15 min，用1∶20驢源溶液在室溫封閉1 h，加入一抗，置于濕盒中4 ℃過夜，經過PBS潤洗3次（5 min/次），室溫孵育二抗2 h，繼續用PBS潤洗3次（5 min/次），棄去液體，用含DAPI的封片液（Sigma-Aldrich，USA）進行封片。采用共聚焦（Olympus FV1000，Japan）進行拍攝成像。所用一抗為：c-fos（1 ∶400，Vector Laboratory，USA）；NeuN（1∶300，Abcam，USA）。

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1.6 免疫組織化學染色 在水迷宮實驗結束后進行免疫組織化學染色，隨機選取對照組、曲唑酮低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠各4只，用生理鹽水進行心臟灌流，用4%多聚甲醛在4 ℃固定過夜，30%蔗糖溶液脫水至沉底。用冰凍切片機（Leica，Germany）將大鼠腦切為30 μm厚度切片，室溫晾干后保存于－80 ℃。

1.7 Western blot 在水迷宮實驗結束后進行Western blot實驗，選擇剩余對照組、曲唑酮低劑量組、曲唑酮中劑量組、曲唑酮高劑量組大鼠各4只，將大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭，在冰上剝離腦組織并分離前額葉皮層區域腦組織。用添加蛋白酶抑制劑 （1 μg/mL Laprotinin，1 μg/mL leupeptin，1 μg/mL pepstatin A） 的RIPA （10 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，0.5%Nonidet P-40）進行組織塊裂解，12 000 g 離 心10 min，用蛋白定量檢測試劑盒（Pierce，美國）對總蛋白濃度進行定量分析。提取20 μg蛋白樣本用SDS-PAGE凝膠分離，轉膜至PVDF膜（Bio-Rad，美國）上；將條帶用4% BSA進行封閉，一抗在4 ℃孵育過夜，二抗室溫1 h，采用化學發光儀（Tanon，中國）進行條帶拍攝。

Stability analysis and treatment of Toudaohe landslide in the Three Gorges Reservoir Area

通過對青春期雄性大鼠腹腔給予不同劑量曲唑酮溶液，聯合對照組，進行了曠場實驗、強迫游泳實驗和水迷宮實驗分析了大鼠的行為，對大鼠的腦組織進行Western blot分析和免疫組織化學染色分析，本研究發現給大鼠腹腔連續注射14 d 20 mg/kg曲唑酮，可以顯著增加大鼠在水迷宮中的空間學習記憶能力、降低大鼠的焦慮和抑郁水平，其中機制可能與曲唑酮抑制前額葉皮層MAPK信號通路、抑制5-HT神經元活性有關。

2 結果

2.1 曲唑酮對大鼠的焦慮水平和抑郁水平的影響 與對照組以及低、高劑量組相比，中劑量組大鼠在曠場箱中運動總路程（

＝20.452，

＜0.001；

＝15.280，

＜0.001；

＝8.446，

＜0.001） 和中央格停留時間（

＝11.971，

＜0.001；

＝10.658，

＜0.001；

＝14.963，

＜0.001） 均顯著增加，低劑量組較對照組顯著增加 （

＝5.62，

＜0.001；

＝3.546，

＝0.003），高劑量組與對照組以上兩個指標相比差異無統計學意義（

＞0.05）；各組大鼠進入中央格次數比較，僅對照組和中劑量組相比差異具有統計學意義，中劑量組較對照組顯著增加（

＝2.696，

＝0.017），其余分組相互比較差異無統計學意義（

＞0.05）；與其余三組比較，中劑量組在水中不動時間顯著降低（

＝3.017，

＝0.009；

＝2.8，

＝0.013；

＝2.523，

＝0.03），而該三組相比差異無統計學意義（

＞0.05），見表1。

2.3 曲唑酮對大鼠5-HT神經元活性的影響 相比對照組以及低、高劑量組，中劑量組大鼠NeuN 標記的神經元表達c-fos 的比例顯著降（

＝2.483，

＝0.042；

＝3.781，

＝0.007；

＝2.388，

＝0.048），而對照組、低、高劑量組相互比較差異均無統計學意義（

＞0.05），見表3。

2.2 曲唑酮對大鼠空間學習記憶能力的影響 相比對照組以及低、高劑量組，中劑量組大鼠在平臺所在象限停留時間（

＝10.671，

＜0.001；

＝13.921，

＜0.001；

＝6.902，

＜0.001）和穿越次數（

＝5.601，

＜0.001；

＝3.685，

＝0.002；

＝3.15，

＝0.007）均顯著增加，而對照組、低、高劑量組相互比較差異均無統計學意義（

＞0.05），見表2。

2.4 曲唑酮對大鼠MAPK信號通路的影響 相比對照組以及低、高劑量組，中劑量組大鼠p-ERK/ERK（

＝3.332，

＝0.013；

＝2.476，

＝0.042；

＝2.886，

＝0.023） 和p-P38/P38表達水平（

＝4.378，

＝0.003；

＝9.148，

＜0.001；

＝3.385，

＝0.012） 均顯著降低，而對照組、低、高劑量組相互比較差異均無統計學意義（

＞0.05），見表4。

奶奶走的時候，一再交代母親不要將鐲子隨她帶進泥土，好給后人留個念頭。其實在她內心是不舍的，奶奶相信輪回轉世，這鐲子是她和爺爺的唯一信物。冥冥中，我似乎感知到，這對鐲子，雖沒有鉆石珠寶金貴，卻承載了太多刻骨銘心的往事，它是名副其實的無價之寶，它正激勵我要為家庭責任和家族的延續而奮斗不止。

3 討論

1.5 水迷宮檢測

強迫游泳實驗結束后進行水迷宮檢測，將每組大鼠放回至原籠位飼養1周，降低大鼠的應激反應，再進行水迷宮實驗。Morris水迷宮設備是一個圓形的水箱，里面裝滿了水，加入鈦粉使水變成白色。水迷宮直徑為120 cm，高50 cm，水溫22～24 ℃。在整個實驗過程中，在水箱的1象限，在水面下1 cm處隱藏一個平臺（直徑為16 cm）。在每一項實驗中，讓大鼠在60 s內找到隱藏的平臺；如果未能在60 s內找到平臺，則手動引導大鼠到隱藏的平臺，并在那里停留30 s。在手術前連續4 d每天進行4次訓練試驗。在每一次試驗中，都要計算大鼠尋找到平臺的時間，即潛時，和大鼠的游泳速度。訓練結束后，移除隱藏平臺測試空間記憶。在此項研究中，移除平臺，計算大鼠通過平臺所在象限的次數和在目標象限花費的時間。所有數據采集通過視頻跟蹤系統獲得。

所用一抗：p-P38 （1 ∶500，Merck Millipore，Germany）；P38 （1 ∶500，Santa Cruz，USA）；p-ERK（1 ∶500，Santa Cruz，USA）；ERK （1 ∶500，Cell Signaling Technology，USA）；GAPDH（1 ∶1 000，Cell Signaling Technology，USA）。

盡管曲唑酮的抗抑郁效果相比其他藥物較弱，但是在一些臨床研究中發現，曲唑酮還有多方面的好處。它能對患者的睡眠產生積極影響，增加睡眠周期中慢波睡眠（SWS）的時間，延長快動眼（REM）起始時間，有多項研究探索了曲唑酮對失眠癥的影響

。曲唑酮還能對焦慮產生一定影響，是應對PTSD的有效藥物，其中機制可能與曲唑酮能增加患者睡眠有關。

為確保在極端工況、防喘振控制系統或閥門定位器等故障情況下也能保護機組,在喘振線與控制線之間設置了一條流量下限安全線（FAL）,當運行點到達安全線（FAL）時,旁路閥快速打開，提高入口流量，同時DCS上將旁路閥閥開度鎖定在100%上，入口導流葉片閥開度鎖定在0%上，壓縮機卸載。

在曠場實驗中，當大鼠出現焦慮心理時，大鼠會對曠場這個新環境表現出恐懼和探究的矛盾心理，焦慮越嚴重的大鼠越傾向沿外周格活動，焦慮情緒越低的大鼠，會在曠場中表現出明顯的探索行為，即進入中央格的次數會增多、在中央格的活動時間也較長。在強迫游泳實驗中，由于大鼠厭惡水，會在裝水的玻璃杯中游動，而抑郁的大鼠會在水中停止不動，通過統計大鼠的不動時間，可以分析大鼠的抑郁情況。在本研究中，我們發現只有在給予大鼠20 mg/kg曲唑酮后，其焦慮水平和抑郁水平相比對照組降低，而在低劑量和高劑量并未產生顯著抗焦慮和抑郁水平，這可能與曲唑酮的副作用有關，在高劑量情況下，曲唑酮會持續抑制鉀離子、鈣離子等偶聯的離子通道，引起包括心臟毒性等的副反應

。

（1）在現代機械制造工藝的發展中，市場經濟發揮著至關重要的作用。現代機械制造工藝更具有市場化，其所包含的包裝以及運輸等等都是為了滿足市場經濟的需求。

由于焦慮、抑郁等疾病常伴有認知功能下降，曲唑酮是否能對認知功能產生影響，目前有較多爭議。在一些額顳葉癡呆和AD患者中，曲唑酮被發現可以對患者的認知功能起到較好的干預效果

，包括促進患者的行為平衡能力和減少患者的攻擊行為等。而在另一項研究中發現，不論是單次給藥還是連續長期給藥，曲唑酮都不會對被實驗者的認知功能產生影響

。在本研究中，我們通過水迷宮對大鼠的認知功能進行測試，發現低、高劑量也不會對大鼠的認知功能產生影響，而在中劑量組，曲唑酮可以增加大鼠對原平臺位置的探索，提示大鼠具有較高的記憶能力。以上結果均表明曲唑酮可以對青春期雄性大鼠的認知功能產生積極影響，但是其作用與給藥劑量密切相關。c-fos作為MAPK信號通路的下游蛋白分子，在病理情況下，其表達水平顯著上升表明神經元過度激活，通常會介導腦組織的損傷過程

。本研究表明：經中劑量曲唑酮干預后，c-fos陽性神經元數量顯著下降，分析其原因在于：c-fos基因可受5-HT誘導上調

，而曲唑酮可拮抗5-HT的Ⅱ型受體，因此大鼠5-HT神經元活性顯著降低。另外MAPK信號通路分子ERK和P38的磷酸化水平降低，表明：曲唑酮可以通過調節MAPK信號通路，抑制前額葉皮層5-HT神經元活性，可一定程度減輕大鼠的腦損傷，促使其神經功能改善。此外5-HT與動物的焦慮、認知等神經行為密切相關

，結合本研究結果：長期服用曲唑酮對睡眠障礙和情緒障礙具有治療作用，其機制可能與藥物影響動物5-HT代謝有關。

本研究也存在一些不足之處：首先，前額葉皮層雖然有大量的5-HT神經元，但是也有其他如膽堿能神經元，而曲唑酮具有較弱的抑制膽堿能神經元的作用，因此，不能排除在本研究中，曲唑酮對膽堿能神經元的調控作用及其貢獻。在之后的研究中，我們將會通過對膽堿能神經元和5-HT神經元分別進行特異性抗體染色，以區分曲唑酮通過不同神經元對中樞神經系統的調控作用。總之，本研究通過不同劑量曲唑酮，探索了其對青春期雄性大鼠神經行為的影響，發現曲唑酮可以降低大鼠的焦慮、抑郁水平，提高認知能力，其中中劑量組作用效果最好，這一過程可能與抑制MAPK信號通路活性、抑制5-HT神經元活性相關。

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