LncRNA-HULC通過穩定SIRT1蛋白調控肝癌Hep G2細胞自噬和化療耐藥的機制

肝細胞癌（HCC）是世界上最常見的人類惡性腫瘤細胞之一，是導致癌癥相關死亡的第二大原因。盡管最近對肝癌的分子基礎和新的化療方法的認識有了進展，但是僅略微降低了死亡率

。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一類長度超過200 nt，沒有或有蛋白質編碼潛力的轉錄本。LncRNA通過在不同水平上調控基因表達來發揮作用，包括表觀遺傳調控、轉錄（或轉錄后）和翻譯調控

。已經證實LncRNA參與了機體的發育、分化、凋亡、自噬、炎癥和癌癥等生理或病理過程

。最近，越來越多的lncRNA被報道在肝癌的癌變和發展中發揮重要作用

。HULC是第一個在人類肝癌組織中特異性過表達的LncRNA

。然而，迄今為止，HULC是否能夠調節HCC細胞的自噬尚不清楚。同時，HULC對化療試劑的反應亦不清楚。本文通過比較對照組 （NOR 組），基因過表達組（O-HULC組），基因抑制組（S-HULC組）肝癌Hep G2細胞的自噬，凋亡，侵襲遷移情況，評價HULC對肝癌Hep G2細胞的細胞自噬和化療耐藥的影響機制。以圖尋找關鍵作用通路及作用靶點，為日后肝癌的治療提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及分組 選取美國ATCC細胞庫來源的Hep G2細胞。細胞分為3組，NOR組、O-HULC組和S-HULC組。NOR組不做處理，正常培養，O-HULC組轉染HULC基因，S-HULC組抑制HULC基因后培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 HULC基因過表達肝癌細胞Hep G2 在感受態的細胞中加入質粒和連接產物，在冰上靜置后于45 ℃下迅速水浴，之后再次置于冰上，在含有抗生素的培養板上培養過夜后按照說明書提取質粒并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA表達，包括純度和表達量。質粒轉染，將生長狀態較好的細胞接種于細胞培養板中，每孔加入含有質粒的無血清培養基，后加入轉染試劑，然后加入到培養箱中培養，每隔10 min搖晃一次，6～8 h后更換培養基。目的基因擴增，提取出RNA后進行PCR擴增，得到cDNA后加入引物，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增后用限制性內切酶酶切，而后siRNA轉染。

1.2.2 肝癌Hep G2細胞侵襲和遷移量檢測 ①細胞侵襲能力檢測：將細胞加入到Transwell的上室中，加入4 μmol/L的奧沙利鉑溶液（美國Sigma公司）之后用伊紅染料將穿過基質膠包裹的下室的肝癌細胞進行染色。然后顯微鏡下進行細胞計數。②細胞遷移能力檢測：將加入奧沙利鉑溶液的細胞加入到Transwell的上室中，然后顯微鏡下對下室的肝癌細胞進行細胞計數。實驗每組平行6次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，計數資料用率表示，組間比較用χ

分析；檢驗水準為α＝0.05，

＜0.05表示差異有統計學意義。

1.2.3 RT-PCR 法測定基因表達量 使用QiagenOneStep RT-PCR試劑盒（美國Qiagen公司，批號：210210）完成qRT-PCR實驗。根據說明書要求，采用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒和TaqManmiRNA分析完成總RNA的聚腺苷酸化和逆轉錄過程。β-actin的表達用作內部對照。被測基因的相對表達利用2

方法計算標準化。每個樣品進行3 次重復測試。每種試劑的量如下：5 μL 2X qPCR Mix，1 μL引物工作溶液（2.5 μM），引物序列見表1，1 μL模板，2.8 μL ddH2O和0.2 μL Rox染料。

2.5 各組肝癌細胞COX-2 和LC3 Ⅱ蛋白表達量 與S-HULC 組相比，NOR 組和O-HULC 組 的COX-2及LC3Ⅱ的蛋白表達量升高，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表6和圖2。

2.2.1 城市建設占用部分耕地面積，導致耕地面積有所減少35.3%，城鎮用地、農村居民點及其他建筑用地的面積有所增加。

2 結果

癌癥細胞的典型特點是增殖迅速，侵襲遷移能力強大，所以侵襲遷移能力是評判癌癥細胞活力的一項重要表觀指標。有報道顯示，癌癥模型小鼠的癌癥程度越嚴重，其癌癥細胞的遷移侵襲能力越強

。研究表明，lncRNA-HULC可以減弱HCC化療藥物如索拉非尼、順鉑、5-氟尿嘧啶（5-fu）等，可降低化療敏感性和細胞凋亡，導致癌細胞存活

。本實驗在應用化療藥物作用細胞后，癌細胞發生凋亡，侵襲和遷移，但是HULC一旦被抑制，侵襲遷移能力降低，凋亡率高于O-HULC組，提示HULC影響癌細胞對化療藥物的敏感性。

發《尋人啟事》尋找女兒，對于由于時間的流逝情緒已稍稍平緩的張秋來說，是有些殘酷和痛苦的，然而，張秋的這種痛苦也同時會激起犯罪分子的快感，犯罪分子很可能會跳出來再往張秋痛苦的心里撒把鹽。

2.4 各組肝癌細胞USP22 和SIRT1 蛋白表達量 與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組的USP22及SIRT1蛋白表達量升高，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表5和圖1。

本文所述土箱產繭應選擇遠離道路的場所，產卵繭期應保持安靜，避免土壤震動，否則正在產卵繭的水蛭會受驚而逃走，造成空繭。首先挖一個深度25cm的矩形淺坑，將網箱鋪蓋在坑上，用越冬分化土（松軟）填滿。接著向網箱中加水，使土濕度保持在30%左右。投放密度為200-300只每平米，投放完成后用透氣紗布將網箱扎起防止水蛭逃離，并蓋上水草或樹枝等進行遮光。在坑四周挖一條排水溝，防止暴雨天氣雨水將網箱浸透，在下雨天氣要及時疏通溢水口。投放后第二日打開網箱檢查水蛭是否都已入土產繭，洞口內有白色泡沫即為水蛭產繭。整個產繭過程持續約12-14天，土壤溫度為20℃左右，每條水蛭平均能產繭3-4個左右。

2.3 各組肝癌Hep G2細胞的細胞遷移和侵襲能力 與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組肝癌Hep G2細胞遷移數量和侵襲數量顯著增加，其中O-HULC組顯著高于NOR組（

＜0.05），見表4。

1.2.4 Western Blot法測定蛋白含量 ①提取蛋白：利用超聲組織破碎儀破碎細胞[破碎條件為4 次/（管·300 W）]，細胞破碎后4 ℃或冰上放置30 min，將破碎后的細胞進行4 ℃離心，12 000 g離心30 min，收集上清液，即為蛋白抽提液。②蛋白定量：使用BCA法測定蛋白濃度。③凝膠電泳：取待測標本15 μL進行上樣，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析，至目的分子量出現。④濕法轉膜：采用濕法將蛋白條帶電轉至Immun-blot PVDF膜上，加入濃度為50 g/L的脫脂奶粉在20 ℃的條件下封閉震蕩處理3 h，加入以下抗體[小鼠抗人USP22單克隆抗體（1∶400）、兔抗人和SIRT1（1∶400）多克隆抗體]，4 ℃孵育過夜。使用經過辣根酶標記的IgG（1∶1 000），在溫度為37 ℃的條件下孵育2 h。⑤發光顯影和圖像分析。

2.2 各組肝癌Hep G2細胞凋亡率 各組添加化療藥物后整體呈現凋亡趨勢，隨著培養時間的延長，細胞的凋亡率逐漸升高，與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組肝癌Hep G2細胞凋亡率降低，其中O-HULC組低于NOR組（

＜0.05），見表3。

3 討論

LncRNA作為一種新型的RNA，由于參與多種細胞過程和在癌癥生物學中發揮重要作用而受到廣泛關注。在HCC中首次發現的lncRNA-HULC已被證實參與包括腫瘤異常生長在內的多個病理過程

。然而，目前相應的機制還不是很清楚。

2.1 各組肝癌Hep G2細胞自噬情況 各組的肝癌Hep G2細胞自噬情況隨藥物添加時間延長而增加，與S-HULC組相比，O-HULC組和NOR組肝癌Hep G2細胞自噬情況顯著增加，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表2。

越來越多的證據表明，自噬的保護作用是導致癌細胞耐藥的重要原因

。自噬是一種保守的分解代謝過程，當細胞在應激條件下或營養缺乏時，負責清除和降解過量或不必要的蛋白質，從而應對饑餓或細胞壓力（如化療藥物）

。因此，更好地了解參與保護性自噬的分子進程，并在化療過程中干預這些關鍵靶點，有助于研究實現肝癌患者干預治療。已證實長鏈非編碼RNA與細胞自噬相關

。如研究發現MTOR激動劑（3BDO）可通過下調LncRNA-FLJ11812促進MIR4459對ATG13的抑制作用，抑制細胞自噬

。LncRNA APF可通過抑制miR-188-3p的水平和活性從而上調ATG7的水平進而誘導細胞自噬

。本實驗也發現相似的結果，發現HULC的過表達可以有效上調肝癌細胞的自噬百分比。但是機制尚不明確，為此，我們將選擇蛋白實驗進一步進行機制驗證。

余熱利用方式可分為熱交換式和吸收式。其中熱交換式是通過利用余熱的焓，將其能量交換出來，轉化為蒸汽或熱水，主要設備有余熱鍋爐、板式換熱器等；吸收式是通過利用余熱的，綜合考慮其熱量及品質，將低品位的能量轉化到另一介質中存在，主要設備有吸收式制冷、吸收式熱泵等。

三是做大水利投融資平臺。省政府成立了省水利發展投資有限公司，注冊資本金50億元，主要由省財政注資，采取多元投資方式，省水利廳管理為主，通過市場融資，解決湖南省水利建設投入不足的問題。各市縣水利投融資平臺通過財政注入資金、金融機構貸款、土地儲備等方式，融資90億元。

USP22是去泛素酶（DUBs）成員

，SIRT1 通 過調控許多自噬關鍵成分，如自噬相關蛋白（Atg）5、Atg7、Atg8、海馬區自噬相關蛋白1（Beclin1）、叉頭轉錄因子O 亞家族1（FoxO1）等誘導自噬

。COX-2可催化花生四烯酸生成前列腺素，介導多種生理和病理過程

。研究表明，COX-2在結直腸、前列腺、乳腺、胃、肺和肝臟等多種人類器官中均有上調

。SIRT1與COX-2是USP22的直接底物，可通過USP22介導去泛素化

。本研究發現與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組的USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表達量升高，其中O-HULC組高于NOR組，說明在HCC細胞中，隨著HULC 被抑制，USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表達量降低。說明HULC可降低肝癌Hep G2細胞對化療試劑的敏感性，從而觸發了肝癌Hep G2 細胞的保護性自噬，可能與信號通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有關，其降低了肝癌細胞對化療藥物的敏感性。

綜上所述，LncRNA-HULC可以穩定SIRT1調控細胞自噬降低細胞對化療藥物的敏感性，可能與信號通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有關，此通路可能是開發肝癌化療新增敏策略的新靶點。

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