7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細胞凋亡及對脛骨生長的影響

研究表明，芳香化酶抑制劑能夠減少生長期體內雄激素向雌激素的轉化，抑制生長板軟骨細胞凋亡，從而起到延緩骨骺閉合，促進身高增長的目的

。而7-羥基黃烷酮作為一種天然產物黃酮類化合物，具有較好的芳香化酶抑制作用

。前期的實驗發現其具有抑制生長板軟骨細胞凋亡的效果，但是最佳藥物濃度尚無定論

。因此本研究對其抑制生長板軟骨細胞凋亡的最佳藥物濃度進行篩選，并對其延遲骨骺閉合促進長骨生長進行驗證，為該藥物的臨床使用及后續實驗提供一定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器1.1.1 主要試劑 0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，IL-1β，來曲唑，7-羥基黃烷酮，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒MTT，膠原蛋白酶Ⅱ，臺盼藍染色液，曲拉通，4'，6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽DAPI溶液，二甲基亞砜DMSO，封閉山羊血清，流式細胞術ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，Ⅱ型膠原抗體Collagen Type ⅡAntibody，熒光封片劑Fluoromount-G。

本文將該滑坡的物理介質概化成滑體土與滑床基巖兩種介質，基于FLAC3D數值分析平臺和該滑坡的幾何形態特征，構建的數值模型如圖10所示。其中，滑體表面的102、100號點分別對應著JCD-1、JCD-2地表GPS監測點。

1.1.2 主要儀器 細胞培養孔板，電子天平，恒溫水浴鍋，37 ℃恒溫細胞培養箱，電熱恒溫震蕩水槽，立式壓力蒸汽滅菌器，高速離心機，高級分析倒置顯微鏡，流式細胞儀，多功能酶標儀，血球計數板。

1.2 實驗方法

1.2.3 流式細胞儀驗證7-羥基黃烷酮對IL-1β引起細胞凋亡的抑制作用 取培養的對數期生長板軟骨細胞，以正常培養的細胞為正常對照組；以20 ng/mL IL-1β誘導每孔細胞凋亡為模型對照組；以加入來曲唑為陽性對照組；以加入40 μM 7-羥基黃烷酮為7-羥基黃烷酮組，各組培養24 h。懸浮棄上清。然后用1mL Binding Buffer重懸細胞。每管加入100 μL細胞（1×10

個）。再向管中加入5 μL Annexin V-FITC。室溫避光，混勻10 min。加入5 μL PI，室溫避光，孵育5 min。加入PBS至500 μL，混勻。1 h內用流式細胞儀檢測。觀察各組細胞凋亡情況，并統計細胞凋亡率。

1.2.1 羊水染色體核型分析 在無菌操作條件下抽取羊水約10ml，并進行接種、培養、收獲、制片、G顯帶及核型分析。

2.2 7-羥基黃烷酮抑制生長板軟骨細胞凋亡的初步藥物濃度篩選 溶劑組及非造模＋用藥組軟骨細胞活率與正常組差異均無統計學意義，培養24 h的10、20、40、60 μM 7-羥基黃烷酮均對生長板軟骨細胞的凋亡有抑制作用，與模型組比較差異均有高度統計學意義（

＜0.01），且作用比陽性對照組好，差異有高度統計學意義（

＜0.01）。其中最佳的藥物濃度為40 μM，見表1。

2013年1月至2015年12月我院對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)患者150例開展了分析研究,患者臨床中都有典型的冠心病癥狀,使用各種診斷方式均確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[3-4]。全部患者共有71例女性患者和79例男性患者,患者最小是55歲,最大是86歲,平均(71.87±13.62)歲。此次我們就患者的臨床病例資料開展了分析比較,患者對此次研究知情且同意參與。

1.2.4 7-羥基黃烷酮對大鼠骨骺閉合及脛骨生長的影響 36只4周齡雌性SD大鼠分為正常對照組、陽性對照組及用藥組，每組各12只。正常對照組每天灌胃去離子水。陽性對照組每天灌胃0.325 mg/kg來曲唑，用藥組每天灌胃100 mg/kg 7-羥基黃烷酮。正常組每15 d拍攝X線片觀察骨骺閉合情況，當正常組閉合數量超過2/3時，對陽性對照組及用藥組同時拍攝X線片觀察骨骺閉合例數并進行記錄。當所有大鼠骨骺均閉合后采用脫頸椎法處死大鼠，使用游標卡尺測量脛骨長度，進行各組間比較。

在拍攝前最好查一下天氣條件是否合適。這個場景中的暗沉天空為James的照片定下了硬朗的基調。沒有這種天氣，涂鴉的背景和粗獷感就不會如此突出。

2.1 軟骨細胞免疫熒光鑒定結果 Ⅱ型膠原是軟骨細胞分泌的特異性膠原，可利用其免疫熒光對軟骨細胞進行鑒定

。大鼠生長板軟骨細胞經培養72 h后進行免疫熒光實驗，結果顯示，在熒光倒置相差顯微鏡下，細胞核經DAPI染色后在不同波段熒光激發出藍色熒光，見圖1A，細胞質被激發出清晰紅色熒光，見圖1B。表明分離培養的細胞表達特征性Ⅱ型膠原，符合軟骨細胞的生物學特征，證明本實驗方法能夠分離培養出純度較高的軟骨細胞，可供進一步實驗研究使用。

2 結果

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0進行統計學分析。對不同濃度7-羥基黃烷酮對生長板軟骨細胞的凋亡影響比較及大鼠脛骨生長長度的影響比較采用單因素方差分析，對大鼠脛骨平臺骨骺閉合例數影響的比較采用χ

檢驗，以

＜0.05為差異有統計學意義。

1.2.1 大鼠生長板軟骨細胞分離培養及鑒定 2只4周齡雌性SD大鼠處死體外分離脛骨生長板軟骨，沖洗并充分剪碎。加入2 mL 1%Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴鍋振蕩5 h后，過濾離心5 min后收集細胞沉淀PBS清洗2次。完全培養基反復吹打混勻制成細胞懸液。血球計數板計數，臺盼藍染色測定細胞的活力。將懸液接種到裝有含10%胎牛血清DMED/F12培養液的T25培養瓶中，置于37 ℃含體積百分數為5%的CO

培養箱中培養。每天觀察細胞生長情況，每2 d換液1次。當細胞接近80%～90%匯合時進行傳代。取傳代的細胞爬片于24孔板中，每孔加入培養基1 mL，加入細胞1×10

個/孔，置于培養箱中過夜培養。細胞爬片后，吸出培養基PBS洗1遍，加入PFA于4 ℃固定30 min。用PBS洗3×5 min/次。最后一次不吸出PBS，4 ℃過夜。除去玻片水分并用封閉液封閉。陽性玻片一抗孵育過夜，陰性玻片不孵育一抗。二抗避光孵育2 h后PBS洗3×5 min/次，染DAPI5min，PBS洗3×5 min/次。玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細胞的一面蓋上。進行細胞鑒定。

1.2.2 MTT法初步觀察7-羥基黃烷酮對生長板軟骨細胞培養的影響 取對數期生長的大鼠生長板軟骨細胞消化處理后，按1×10

/孔接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO

培養箱，正常培養的細胞為正常對照組；模型對照組和陽性對照組加入20 ng/mL IL-1β誘導細胞凋亡，陽性對照組中同時加入5 μm來曲唑；以配制藥物的DMSO溶液為溶劑組；以正常細胞加入濃度為40 μM 7-羥基黃烷酮為非造模＋用藥組；以加入20 ng/mL IL-1β的同時分別加入濃度為10、20、40、60 μM 7-羥基黃烷酮的培養液為實驗1～4組。每孔200 μL，每組設6個復孔。置于37 ℃，5% CO

培養箱分別培養24 h和48 h后，取出96孔板，將20 μL MTT溶液加入到每個培養孔中，繼續培養4 h后，取出96孔板，吸除培養基，每孔加入150 μL Formazan溶液，置搖床上低速振蕩30 min，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在OD 570 nm處測量各孔的吸光值。

支撐架(圖2)的作用首先是用于承受壓裝時裝置所受的的軸向載荷，在裝置吊運時承受整個裝置的重力，要求結構呈360°等分，剛度大。為此我們設計成采用Q235材料的工字型的六根梁，并且在兩邊各焊了25 mm厚的Q235鋼板作為加強筋，焊后去應力退火。其次，支撐架將作為液壓站、拉桿連接套、電接點壓力表、吊耳等的載體，面積較大，我們將這些零部件，均勻地布置在支撐架的上方，避免吊運時發生傾斜。

2.3 流式細胞儀驗證7-羥基黃烷酮對IL-1β引起細胞凋亡的抑制作用 流式細胞儀檢驗結果顯示，正常組幾乎均為正常活細胞，模型組各時期凋亡細胞較多，陽性對照組可以抑制生長板軟骨細胞凋亡，而7-羥基黃烷酮組效果略優于陽性對照組，見圖2。在細胞凋亡率方面也得到相同結果，見圖3。

2.4 7-羥基黃烷酮對大鼠骨骺閉合及脛骨生長的影響 當模型組大鼠脛骨平臺骨骺閉合例數超過2/3 時，用藥組及陽性對照組的骨骺閉合例數均少于模型組（

＜0.01），見表2。通過對同一時間點模型組與用藥組及陽性對照組大鼠脛骨平臺X線片顯示，模型對照組大鼠骨骺閉合，而用藥組及陽性對照組大鼠骨骺未閉合。最終對大鼠脛骨長度測量，結果顯示用藥組大鼠脛骨長度長于模型對照組及陽性對照組（

＜0.05），見表3。

3 討論

骨骼增長結束的標志是骨骺閉合，而骨骺閉合以生長板軟骨細胞的凋亡為直接誘因，由生長后期過高的雌激素導致

。雌激素是女性主要的性激素，主要由卵巢分泌或雄性激素經芳香化酶轉化而來

。女性身體中的部分和男性身體中的大部分雌激素都是以雄激素為來源，從皮膚、脂肪、神經等周邊組織由芳香化酶轉化而來

。因此，如果能抑制芳香化酶將雄激素轉化為雌激素，理論上就能夠減少生長板軟骨細胞凋亡，延緩骨骺閉合，促進身高增長。芳香化酶是細胞色素P450酶系中的一種混合功能氧化酶，其主要作用是將睪酮和雄烯二酮轉化為雌二醇和雌酮，即雄激素向雌激素的轉變

；而芳香化酶抑制劑（AIS）可以抑制這一反應，從而降低向雌激素轉化，進而達到延緩骨骺閉合的目的。由于芳香化反應是類固醇激素生物合成過程中獨特的反應，而且雌激素是這種反應的最終產物，因此芳香化酶抑制所導致的雌激素減少不會影響其他類固醇激素的產生，故AIS可以應用于臨床

，例如第三代非甾體類AIS來曲唑，具有高選擇性、可逆性和高效性等特點，目前已廣泛應用于乳腺癌、子宮內膜癌以及青春期特發性身材矮小男童的等疾病治療當中

，因此，研發新一代效果好、不良反應少的芳香化酶抑制劑成為研究的熱點。

天然產物一直是創新藥物及其先導化合物的來源之一，具有化學種類多、結構新穎等特點

，其中7-羥基黃烷酮作為天然黃酮類化合物的一種，研究發現其具有較好的芳香化酶抑制作用，但對于其最適藥物濃度，臨床上尚無統一定論

。因此，本次研究對7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細胞凋亡的最適藥物濃度進行篩選。我們首先采用倒置相差顯微鏡及Ⅱ型膠原免疫熒光實驗對分離的大鼠生長板軟骨細胞進行鑒定，從而為后續實驗提供基礎。隨后建立正常對照組、模型對照組、陽性對照組、溶劑組、非造模＋用藥組以及實驗1～4組并對各組軟骨細胞凋亡情況進行比較。最終得到抑制大鼠軟骨細胞凋亡的最佳藥物濃度為40 μM，同時通過體外動物實驗證實，7-羥基黃烷酮的確能夠延緩骨骺閉合，從而促進脛骨生長。基于此，我們認為本次實驗證實7-羥基黃烷酮能夠延緩大鼠骨骺閉合，促進脛骨增長，其機制可能與通過藥物抑制芳香化酶反應，從而降低雌激素轉化，進而抑制生長板軟骨細胞凋亡有關。而在7-羥基黃烷酮抑制大鼠生長板軟骨細胞凋亡，最適藥物濃度篩選中，40 μM濃度效果最佳，這也為今后該藥物應用臨床提供了實驗數據和理論支持。

綜上所述，本次研究結果顯示，7-羥基黃烷酮能夠抑制大鼠生長板軟骨細胞凋亡，最適藥物濃度為40 μM。此外，體外實驗證實給予大鼠灌胃7-羥基黃烷酮的確能夠延緩骨骺愈合，促進脛骨生長。

[1] 歐陽力雪，楊凡.芳香化酶抑制劑在矮身材青少年男童中的應用研究進展[J].中華實用兒科臨床雜志，2020，35（9）：712-715.

[2] 徐文珊，黃鳴清，陳修平，等.天然產物來源的芳香化酶抑制劑研究進展[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：1008-1011.

[3] SANDERSON J T，HORDIJK J，DENISON M S，et al.Induction and inhibition of aromatase （CYP19） activity by natural and synthetic flavonoid compounds in H295R human adrenocortical carcinoma cells[J].Toxicol Sci，2004，82（1）：70-79.

[4] 高偉華，李玉杰，楊鴻冉，等.加味陽和湯對膝骨性關節炎軟骨細胞凋亡的影響研究[J].中國中醫骨傷科雜志，2021，29（1）：1-5，10.

[5] BAEK D，LEE K M，PARK K W，et al . Inhibition of miR-449a Promotes Cartilage Regeneration and Prevents Progression of Osteoarthritis in In Vivo Rat Models[J].Mol Ther Nucleic Acids，2018（13）：322-333.

[6] KANG B H，CHO J H，KIM S Y，et al.Growth and Bone Mineral Density Changes in Ovariectomized Rats Treated with Estrogen Receptor Alpha or Beta Agonists[J].J Korean Med Sci，2020，35（45）：e370.

[7] AWASTHI M，SINGH S，PANDEY V P，et al.Molecular docking and 3D-QSAR-based virtual screening of flavonoids as potential aromatase inhibitors against estrogen-dependent breast cancer[J].J Biomol Struct Dyn，2015，33（4）：804-819.

[8] KONG Y，CHEN H，LIANG L，et al.Aromatase inhibitors combined with growth hormone in treatment of adolescent boys with short stature[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2020，25，49（3）：283-290.

[9] 鐘救根，侯曉暉，蘭號.芳香化酶抑制劑相關關節痛研究進展[J].中國康復理論與實踐，2019，25（7）：805-812.

[10] 王陽，李偉鵬，李政，等.芳香化酶抑制劑治療男性不育癥的研究進展[J].中華泌尿外科雜志，2019，40（10）：798-800.

[11] 喬曉紅.芳香化酶抑制劑在兒科領域應用研究進展[J].世界臨床藥物，2020，41（3）：160-165.

[12] 林娟，馬華梅，李燕虹，等.來曲唑對青春早中期男童生殖功能與線性生長的近期影響[J].中山大學學報（醫學版），2018，39（3）：386-392.

[13] 孟春艷，張付菊，蘇永平.來曲唑在乳腺癌輔助內分泌治療中的研究進展[J].癌癥進展，2021，19（5）：438-441.

[14] 豆竹麗，阮祥燕，鞠蕊，等.綜合干預后多囊卵巢綜合征不孕患者應用來曲唑促排卵的臨床效果[J].首都醫科大學學報，2020，41（4）：525-529.

[15] 崔蘊璞，王新利.來曲唑治療青春期特發性矮身材男童的臨床觀察[J].中國當代兒科雜志，2019，21（10）：977-982.

[16] 李坤，楊義芳.天然產物及其衍生物中的芳香化酶抑制劑[J].中草藥，2008，39（9）：1417-1424.

[17] 付志鵬，周忠霞，劉新泳，等.天然產物抗病毒藥物的研究進展[J].藥學學報，2020，55（4）：703-719.