穩定同位素標記化合物在我國分析檢測領域中的應用進展*

徐仲杰， 張 雨， 雷 雯， 胡祖明

(1.東華大學材料科學與工程學院化纖與高分子材料改性國家重點實驗室 上海 201620；2.上海化工研究院有限公司技術開發中心 上海 200062)

近年來，隨著同位素稀釋質譜法在檢測中的普遍應用，對作為其內標試劑的穩定同位素標記化合物的需求日益增長，促使穩定同位素標記技術迅猛發展。目前以代謝組學、蛋白質組學、臨床質譜為代表的現代生物技術發展迅速，同時越來越多的生物技術引入醫藥產業，使得生物醫藥產業化進程明顯加快。在生物工程、生命科學及新藥研發等領域，以同位素示蹤技術為核心的代謝組學獲得廣泛應用。

當前穩定同位素稀釋質譜法在環境領域的應用日漸廣泛，這是由于穩定同位素內標在特定環境污染源中的結構特殊，同時具有在遷移及反應過程中結構穩定、檢測結果精密度高和準確度好等特點，已被大量應用于環境污染物來源分析以及環境污染事件仲裁。

十八大以來，我國為保障人民“舌尖上的安全”，進而更好地保證人體健康，對食品安全問題高度重視，將其提升到國家戰略的高度。為響應國家發展戰略，越來越多的檢測標準、科學研究傾向于選擇靈敏度高、準確性好的檢測方法，應用于食品中農獸藥殘留、違禁添加劑等的檢測，穩定同位素稀釋質譜法以其獨特的優勢發揮了巨大的作用。

1 穩定同位素標記化合物在生物醫藥領域的應用

在生物醫藥領域，穩定同位素標記化合物主要作為示蹤劑追蹤生物體內能量、糖類、脂質等特定代謝通路，得到機理信息，或作為內標試劑應用于蛋白質準確定量及代謝相關疾病的診斷。

1.1 代謝組學

代謝組學是新興組學技術，是在基因組學以及蛋白質組學后發展起來的。近年來，基于同位素示蹤技術的代謝組學被廣泛應用在生物工程、生命科學及藥物研發領域。通過引入帶有穩定同位素標記的示蹤劑，追蹤生物體內特定代謝通路及代謝物的情況，從而為合成生物學、疾病致病機理研究、藥物代謝及作用機理研究提供依據。

付慧等[1]以氘或13C標記的穩定同位素標記化合物為內標，采用液液萃取-高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質譜法對人體尿中8種多環芳烴代謝物同時進行定量分析，檢測時加入的同位素內標試劑為1-羥基萘-D7、2-羥基芴-D9、3-羥基芴-D9、13C12-2,3,3′,4,4′-五氯聯苯等，多環芳烴代謝物的檢出限可達0.006～0.042 μg/L。

張秀堯等[2]以穩定同位素標記去甲地西泮-D5為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法對人血漿和尿液中42種精神藥物及其代謝產物進行了快速準確檢測，其中巴比妥類藥物的檢出限為20～100 mg/L，其余藥物的檢出限為0.05～2.0 mg/L。

朱婧等[3]以同位素標記苯巰基尿酸-D2、N-乙酰基-S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸-13C,D3、N-乙酰基-S-苯基-L-半胱氨酸-13C6等為內標試劑，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定尿中苯系物以及三氯乙烯代謝產物，方法的檢出限低至0.035 0～1.75 μg/L。

陳躍等[4]使用甲基苯丙胺-D5、嗎啡-D3、O6-單乙酰嗎啡-D3為內標，利用超高效液相色譜-串聯質譜法，對人體唾液中3種毒品(甲基苯丙胺、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡)及其代謝物進行檢測，3種毒品的檢出限為0.02～0.05 μg/L。

王佳曼等[5]采用液相色譜-串聯質譜法，以20種穩定同位素標記化合物做內標，對特應性皮炎患者中氨基酸、有機酸、脂肪酸等物質的代謝情況進行研究，所使用的內標包括12種氨基酸，分別為甘氨酸-15N，13C、丙氨酸-D4、纈氨酸-D8、亮氨酸-D3、蛋氨酸-D3、苯丙氨酸-D5、酪氨酸-13C6、天冬氨酸-D3、谷氨酸-D3、瓜氨酸-D2、鳥氨酸-D2、精氨酸-D4,13C；8種酰基肉堿內標，分別為游離肉堿-D9、乙酰肉堿-D3、丙酰肉堿-D3、丁酰肉堿-D3、異戊酰肉堿-D9、辛酰肉堿-D3、肉豆蔻酰肉堿-D9、棕櫚酰肉堿-D3。

凌家俊等[6]以氘代尼古丁為內標，利用穩定同位素微透析采樣技術，對尼古丁經皮制劑的整體及大腦局部的藥代動力學進行了相關研究，為新型給藥系統的體內過程研究提供了新的思路和研究方法。

楊旭等[7]以紅霉素-D6為內標，使用液相色譜-串聯質譜法，對血漿中琥乙紅霉素及其活性代謝產物紅霉素進行了同時測定，并在比格犬體內的藥代動力學研究中也進行了應用，血漿中琥乙紅霉素及紅霉素的定量下限分別為4、2 ng/mL。

1.2 蛋白質組學

有定量蛋白質組學“化學標簽”之稱的穩定同位素(如2H、13C、15N和18O)標記的多肽及氨基酸，在生物樣品的測試及示蹤等領域的應用愈加普遍。由于穩定同位素特異肽段的理化性質與目標肽段完全一致，因此其色譜-質譜行為也一致，能有效校正由復雜的基質效應可能引起的檢測響應值的波動。

杜鵑等[8]采用超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法，對乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行了測定，使用同位素特異肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作為內標，在預處理之前加到被測樣品中。試驗結果表明，選用同位素標記內標肽段不但能降低基質效應，還能校正樣品前處理過程的誤差。

胡蓓等[9]以同位素內標肽LSQSKVL*PV*PQK(L*：Leu-OH-13C6，15N；V*：Val-OH-13C5，15N)做內標，對嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量進行了定量分析，該方法的定量下限可達10 mg/kg。

任文華等[10]以13C、氘標記糖化賴氨酸及賴氨酸為內標，對血清糖化白蛋白進行測定。該方法在相關性、精密度、正確性等方面都優于常規酶法，被推薦為我國糖化白蛋白測定的候選參考方法。

李佳樂等[11]采用13C5-脯氨酸、13C9-苯丙氨酸、13C5-纈氨酸為內標，對人血清白蛋白純品含量采用超高效液相色譜-同位素稀釋質譜(HPLC-IDMS)測定。該方法作為純品人血清白蛋白標準物質的定值方法，對保證臨床檢驗中測定結果的量值溯源性具有重要的意義。

沈蕾等[12]以13C5-纈氨酸、13C9,15N-苯丙氨酸為內標，利用液相色譜-串聯質譜法，成功實現人重組蛋白胱抑素C的準確定量。

齊開倫等[13]以同位素標記肽段做內標，對雞蛋中3種主要致敏蛋白溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵白蛋白進行了超高效液相色譜-串聯質譜檢測。該方法用于測定烘焙食品中3種致敏蛋白，其定量限為0.4～10.0 μg/g。所使用的同位素標記特異肽段分別為：HG[13C-15N-L]DNYR、FESN[13C-15N-F]NTQATNR、GTDVQAW[13C-15N-I]R、KDSN[13C-15N-V]NWN-NLK、Y[13C-15N-F]GYTG-ALR、[13C-15N-I]RDLLER、AFKDEDTQAMP[13C-15N-F]R、LTEWTSSN[13C-15N-V]MEER、ISQA[13C-15N-V]HAAHAEINEAGR。

2 穩定同位素標記化合物在環境科學領域的應用

目前，以穩定同位素標記試劑為內標的同位素稀釋質譜法已廣泛應用于環境中抗生素殘留、揮發性有機物、環境激素等的檢測及相關研究；同時，由于同位素稀釋質譜法在檢測中的優勢作用，我國針對環境中有害物質的檢測所發布的一系列標準，越來越傾向于采用穩定同位素標記試劑做內標。

2.1 環境檢測研究

陳磊等[14]以穩定同位素氘標記恩諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星為內標，采用QuEChERS前處理結合超高效液相色譜-串聯質譜法，對土壤中19種氟喹諾酮類抗生素殘留進行快速測定，方法檢出限為0.2～1.0 μg/kg，操作簡單，準確度高。

趙超群等[15]以磺胺地索辛-D6、磺胺喹噁啉-13C6、磺胺甲基嘧啶-13C6、磺胺甲噁唑-D4為內標，采用固相萃取凈化富集結合超高效液相色譜-串聯質譜法，對飲用水中17種磺胺類藥物殘留進行定量分析，17種磺胺類藥物的定量限均低于0.025 3 μg/L。

曾玉珠等[16]采用固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術，測定了4種不同水體(地表水、廢水、飲用水源水及生活用水)中6種環境激素類污染物——雌三醇、17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚的含量。該方法采用雌三醇-D3、17-β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8做內標，多反應監測模式進行分析，方法的定量限為1.08～1.78 ng/L。

劉星等[17]采用13C標記PCB28、PCB111、PCB178、PCB141做內標，利用氣相色譜-三重四極桿質譜法，建立了海洋沉積物中28種痕量多氯聯苯的檢測方法，方法的線性范圍為0.1～50 ng/mL，定量范圍為0.009～0.052 μg/kg，方法的靈敏度高，抗干擾能力強。

秦威振等[18]建立了室內灰塵中5種有機磷酸酯阻燃劑的定量分析方法。該方法使用穩定同位素氘標記有機磷酸酯做內標，通過超聲輔助提取，同時結合固相萃取的方式進行樣品的前處理，利用高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測，方法的檢出限為1.8～36.0 ng/g，定量限為5.9～120.0 ng/g，所使用同位素內標分別為磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯-D15、磷酸三(2-氯丙基)酯-D18、磷酸三苯酯-D15等。

2.2 環境標準

目前，穩定同位素內標已廣泛應用于環境中有害物質的檢測，我國針對水質、土壤、固體廢物、空氣中有害物質的檢測也發布了一系列的環境保護標準。近幾年應用同位素內標進行有害物質檢測的環境保護標準匯總見表1。

表1 應用同位素內標進行有害物質檢測的環境保護標準匯總

3 穩定同位素標記化合物在食品安全領域的應用

在食品安全領域，穩定同位素標記內標試劑主要應用于農獸藥殘留檢測，非法及濫用添加劑、遷移污染物、毒素等的檢測。杜曉寧等[36]對同位素稀釋質譜法在食品中有害物質檢測的應用進行了綜述，并介紹了其在檢測以及國家或行業標準中的應用情況。

廖朝選等[37]采用同位素稀釋超高效液相色譜-串聯質譜技術，對豆制品中16種喹諾酮類藥物殘留進行了測定。該方法使用的同位素內標有諾氟沙星-D5、環丙沙星-D8、恩諾沙星-D5，16種喹諾酮類藥物的檢出限為0.5 μg/kg，平均回收率為80.7%～107.1%。

邱福保等[38]使用超高效液相色譜-串聯質譜法，對谷物制品中18種真菌毒素進行了檢測，方法的檢出限和定量限分別為0.03～4 μg/kg和0.25～15 μg/kg，所使用的穩定同位素內標試劑分別為U-[13C17]-黃曲霉毒素B1、U-[13C17]-黃曲霉毒素B2、U-[13C17]-黃曲霉毒素G1、U-[13C17]-黃曲霉毒素G2、U-[13C17]-黃曲霉毒素M1、U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏馬毒素B2、U-[13C34]-伏馬毒素B3、U-[13C24]-T-毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏馬毒素B1、U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、U-[13C15]-瓜萎鐮刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮。

韓超等[39]采用同位素稀釋氣相色譜-串聯質譜法，測定了動物源食品中克霉唑殘留量。該方法使用克霉唑-D5做內標進行定量，校正了目標物的損失，提高了測量結果的穩定性和重復性，保證方法有較好的回收率和精密度。該方法靈敏度高、準確性好，定量限為2.0 μg/kg，回收率為82.6%～116.5%，相對標準偏差為5.2%～13.5%，能夠滿足豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎中克霉唑殘留量的確證和定量分析，為保障食品安全提供技術支持。

廖艷華等[40]以氘代甲醛DNPH-3,5,6-D3為內標建立了測定水產品中甲醛的檢測方法，方法的檢出限為1.0 μg/kg。

王艷等[41]建立了奶粉及保健食品中左旋肉堿含量的檢測方法。該方法以左旋肉堿-D3為內標，樣品經溶解、蛋白沉淀、超聲提取、離心、過濾后，采用高效液相色譜-高分辨質譜法進行測定，使用同位素內標避免了外標法定量時基質的干擾，方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg。

毛思浩等[43]采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時結合全自動固相萃取技術，測定了蜂蜜中4種硝基呋喃代謝物。該方法以AMOZ-D5、AHD-13C3、AOZ-D4、SEM-15N213C1為內標定量，方法檢出限為0.04～0.08 μg/kg，在0.25、1.25、2.50 μg/kg水平進行加標試驗，平均回收率為100.6%～102.3%。

4 展望

由于同位素稀釋質譜法在痕量分析中消除基質干擾方面具有獨特的技術優勢，在檢測及科研中的應用日益廣泛，對內標試劑的需求也隨之飛速增長，目前國內檢測及科研中所使用的穩定同位素標記內標試劑大多數從國外進口。隨著我國對科研用高端試劑的日益重視，越來越多的擁有自主知識產權的穩定同位素標記試劑將進入市場，助力我國生物醫藥、環境科學、食品安全等領域的科研及檢測工作。