黃淮麥區71個小麥品種的赤霉病抗性與基因型分析

胡文靜，高德榮，江 偉，廖 森，馬紅勃，張曉祥

(1.江蘇里下河地區農業科學研究所/農業農村部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225007；2.揚州大學/江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇揚州 225009； 3.長江大學農學院，湖北荊州434023；4.江蘇徐淮地區徐州農科所，江蘇徐州221131 )

小麥赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由禾谷鐮孢菌(FusariumgraminearumSchw.)等多種鐮刀菌引起的世界性病害，常發生在溫暖濕潤地區。小麥開花期遇到連續陰雨且氣溫在15℃以上時，赤霉菌侵染小麥穗部并迅速擴展，在籽粒灌漿成熟過程中不斷繁殖，并產生和累積多種毒素，導致小麥產量受損、品質降低，甚至造成食品安全問題，危害人畜健康[1]。因此，選育和推廣抗赤霉病小麥品種是解決赤霉病危害最安全、經濟和有效的途徑[2]。長江中下游麥區是我國小麥赤霉病的重發區，選育抗赤霉病的小麥品種一直是該麥區重要育種目標，自上世紀80年代以來，該麥區育種家相繼選育出一批赤霉病抗性較好的小麥品種，如揚麥4號、揚麥5號、揚麥158、蘇麥3號等，此外，一些農家品種，如望水白、黃方柱、白三月黃等，也都呈現出穩定的赤霉病抗性，這些品種已被國內外小麥育種單位作為赤霉病抗源使用[2-4]。由于黃淮麥區歷史上缺少赤霉病的誘發環境，育種家對抗病品種的關注較晚，造成一旦氣候變化和耕作制度改變，該麥區的赤霉病危害迅速蔓延和加重[5-6]。因此，發掘和利用小麥抗赤霉病種質資源，培育赤霉病抗性達到中感及以上水平的小麥品種已經成為黃淮麥區的主要育種目標之一[7]。

培育抗赤霉病小麥品種離不開抗赤霉病基因的利用。近年來，國內外對小麥抗赤霉病基因的研究進展迅速，為小麥赤霉病抗性遺傳改良奠定了理論基礎。目前共定位到250余個赤霉病抗性基因/QTL，分布在小麥21條染色體上[1]，但明確的抗赤霉病基因只有7個，即Fhb1～Fhb7，其中Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7是赤霉病抗擴展類型，Fhb4和Fhb5是赤霉病抗侵染類型，Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5來源于普通小麥，Fhb3、Fhb6和Fhb7來源于外緣種質[8-12]。目前已知效應值較大的抗赤霉病QTL有QFhs.crc-2DL、Fhb7AC和QFhb.cau-7DL[13-15]。蘇麥3號等長江中下游麥區的抗赤霉病品種雖然赤霉病抗性穩定，但這些品種與我國黃淮麥區的小麥品種遺傳背景差異太大，在株型、生育期等方面具有顯著差異，利用它們改良該麥區品種的赤霉病抗性需要的育種周期很長，甚至最終會因為抗性基因丟失導致抗赤霉病育種失敗。迄今在黃淮麥區罕見選育出赤霉病抗性較好的品種[16]，因此從該區域內篩選優良赤霉病抗源用于小麥遺傳改良顯得尤為重要。前人在黃淮麥區已開展了一些篩選抗赤霉病小麥品種(系)的研究[17]，如張 煜等[6]采用土表接種結合單花滴注的方法對黃淮南部762個小麥品種(系)的赤霉病抗性進行鑒定，僅篩選出10個穩定的中抗赤霉病小麥品種(系)。張 彬等[18]對黃淮南片65個主栽小麥品種進行了赤霉病抗性鑒定，發現黃淮南片主栽小麥品種的赤霉病抗性普遍較差。本研究以71個黃淮麥區小麥品種(系)為材料，連續兩年采用單花滴注接種的方法，對供試品種(系)進行赤霉病抗性鑒定，并利用與Fhb1[19-20]、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因[6]和QFhs.crc-2DL位點[13]緊密連鎖的分子標記對供試材料進行檢測及分析，以期為該麥區小麥抗赤霉病育種提供遺傳資源與信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

71份供試品種(系)分別來自江蘇、安徽、河南、山東、陜西、河北和北京，分別以蘇麥3號、鄭麥9023、淮麥22和濟麥22為赤霉病抗病(Resistant，簡稱R級)、中抗(Moderately resistant，簡稱MR級)、中感(Moderately susceptible，簡稱MS級)和感病(Susceptible，簡稱S級)對照品種。

禾谷鐮孢菌菌株(F0301、F0609、F0980和F1312)由江蘇省農業科學院植物保護研究所陳懷谷研究員惠贈。

1.2 試驗設計

試驗于2016―2017和2017―2018年度2個小麥生長季在江蘇里下河地區農業科學研究所揚州灣頭試驗基地赤霉病鑒定圃內進行。播種日期均為每年的10月25日。每品種種植2行，行長1.5 m，行距25 cm，每行均勻播種30粒種子，2次重復。土質為沙壤土，前茬為水稻，肥力中等，田間管理如施肥、除草、灌溉和蟲害防治同常規育種田。

1.3 赤霉病抗性鑒定與評價

參照Yu等[21]的方法制備赤霉菌孢子懸浮液(1×105～ 5×105個·mL-1)。

接種方法：采用單花滴注法接種，于小麥開花初期，用注射器吸取10 μL孢子液注入麥穗自頂部小穗開始自上而下第6個小穗的任意一個小花中，每個品種接種20個穗子，2次重復。接種后采用人工彌霧保濕(每半小時彌霧5 min)21 d。

抗性評價方法：接種21 d后調查接種穗的病小穗數，計算病小穗率。病小穗率=發病小穗數/總小穗數×100%。病情嚴重度調查和記載標準按照《中華人民共和國農業行業標準 NY/T 2954-2016：小麥區域試驗品種抗赤霉病鑒定技術規程》[22]和張曉軍等[23]的方法進行，嚴重度分級標準：接種小穗無可見發病癥狀，0級；僅接種小穗發病，或相鄰的個別小穗發病，但病斑不擴展到穗軸，1級；穗軸發病，發病小穗占總小穗數的1/4以下，2級；穗軸發病，發病小穗占總小穗數的 1/4～1/2，3級；穗軸發病，發病小穗占總小穗數的1/2以上，4級。每年調查2次各病穗的病情嚴重度，再根據連續2年的平均嚴重度分級，將供試品種分為抗病(R級，0<平均嚴重度<2.0)、中抗(MR級，2.0≤平均嚴重度<3.0)、中感(MS級，3.0≤平均嚴重度<3.5)和感病(S級，平均嚴重度≥3.5)四個等級。

1.4 赤霉病抗性基因(QTL)的分子檢測

每品種(系)選取10粒種子，室溫下發芽，取嫩葉放入液氮中速凍，采用CTAB法[24]提取基因組DNA。采用與Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位點連鎖的標記(表1)對供試材料進行檢測，檢測所用的陰性對照品種均為鄭麥9023，其中Fhb1參考Rasheed等[25]的檢測方法，以蘇麥3號為陽性對照，檢測結果與陽性對照品種一致的，說明該品種(系)可能攜帶Fhb1基因。Fhb2、Fhb4和Fhb5基因參考張 煜等[6]的檢測方法，均以望水白為陽性對照。QFhb.crc-2DL位點的檢測以揚麥158為陽性對照，PCR反應體系為10 μL，包含2×Taq MasterMix(P114-03，中國南京諾唯贊生物科技有限公司)5.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.1 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)1.0 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位點的兩側連鎖標記與陽性對照品種檢測結果一致，說明該品種(系)可能攜帶有該抗性基因/QTL。

表1 赤霉病抗性基因/QTL相應分子標記信息

1.5 數據統計分析

利用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試品種(系)的赤霉病抗性

根據2016-2017和2017-2018兩年度的赤霉病抗性鑒定結果，共篩選到赤霉病抗性達中抗的品種(系)5個，占供試品種總數的7.0%，分別為皖麥32(安徽)、皖麥31(安徽)、新鄉289(河南)、西農511(陜西)和徐麥DH9(江蘇)，平均病小穗率為19.3%～26.3%，平均嚴重度為2.0～2.5；赤霉病抗性達中感的品種(系)17個，占供試品種總數的24.0%，11個來自江蘇，4個來自河南，1個來自安徽，1個來自山東，平均病小穗率為28.9%～48.5%，平均嚴重度為3.0～3.4；感赤霉病的品種(系)有49個，占供試品種總數的 69.0%，10個來自江蘇，24個來自河南，10個來自山東，2個來自安徽，其他3個分別來自陜西、北京、河北，平均病小穗率為48.6%～ 78.8%，平均嚴重度為3.5～4.0。沒有鑒定到赤霉病抗性達“抗”的品種(系)(表2)。

表2 71個小麥品種(系)的抗赤霉病鑒定結果

(續表2 Continued table 2)

2.2 赤霉病抗性基因/QTL的分子標記檢測結果

利用與Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點緊密連鎖的分子標記對供試品種(系)進行基因型分析，結果(表3)顯示，徐麥DH9和淮麥40可能同時攜帶Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點，太麥198可能僅攜帶Fhb4基因，明麥16和皖麥32可能僅攜帶QFhs.crc-2DL位點。其他品種(系)未檢測到所檢測基因/QTL。

表3 赤霉病抗性基因/QTL的分子標記檢測結果

3 討 論

3.1 抗赤霉病種質資源篩選

單花滴注接種結合彌霧保濕是鑒定小麥赤霉病抗性最有效的方法。除對照品種蘇麥3號外，本試驗未鑒定到赤霉病抗性水平達到“抗”的品種(系)，說明黃淮麥區匱乏抗赤霉病的品種，這與張 煜等[6]和張 彬等[18]的研究結果一致。本研究發現，西農511、徐麥DH9、皖麥32等22個品種(系)對赤霉病的抗性達到中抗或中感水平，說明這22個品種(系)赤霉病發病較輕，在赤霉病發病年份結合藥劑防治可在一定程度上控制病害的發生。經分析發現，上述22個對赤霉病表現為中抗或中感的小麥品種(系)大多來自或者適宜種植在江蘇、安徽的北部和黃淮南部。2010年以來，隨著氣候的變化，小麥赤霉病在上述地區已由偶發性病害轉變為常發性病害，該麥區的育種家們相繼把培育中感及以上水平的小麥品種納入育種目標，因此上述抗性較好的品種(系)無疑是育種家根據育種目標不斷選擇的結果，這些品種(系)的株高、穗數等農藝性狀與當地的生態環境相適應，相較于蘇麥3號、望水白等長江流域的抗源，這些品種(系)更適宜用于該麥區抗赤霉病小麥品種的遺傳改良。

3.2 抗赤霉病基因/QTL分析

Fhb1基因是目前國內外唯一公認的抗赤霉病主效基因[26]，Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點是目前已報道的赤霉病抗性效應值較大且穩定的基因/QTL。本研究利用與這些基因/QTL緊密連鎖的分子標記對供試品種(系)進行檢測，發現大多數黃淮麥區小麥品種(系)不攜帶這些基因/QTL，原因可能是這些基因/QTL的來源是長江中下游麥區的地方品種和改良品種[20,27]，說明來源于長江中下游麥區的抗赤霉病品種或者抗性基因可能還未在黃淮麥區的抗赤霉病育種中廣泛實踐。本研究抗赤霉病表型鑒定是在長江中下游地區揚州的彌霧保濕圃內進行，小麥開花至灌漿時期滿足高溫高濕的赤霉病誘發條件，因此，赤霉病抗性鑒定表現為中感及以上水平的品種(系)可以被認定為赤霉病發病較輕、抗性較好的種質資源。抗赤霉病基因/QTL緊密連鎖標記檢測結果顯示，國內外公認的赤霉病抗性最好的蘇麥3號同時攜有Fhb1、Fhb2基因和QFhs.crc-2DL位點，說明抗病基因/位點的聚合效應顯著。本研究還發現，可能同時攜有Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點的品種有徐麥DH9和淮麥40，赤霉病抗性分別達到中抗和中感，系譜分析表明，徐麥DH9的赤霉病抗性來源于H35，而淮麥40來自太谷核不育輪回選擇，其抗病基因的來源尚不清楚；皖麥32和明麥16可能僅攜帶QFhs.crc-2DL抗性位點，對赤霉病分別表現為中抗和中感，其中皖麥32的赤霉病抗性來自揚麥158，而揚麥158攜有多個抗赤霉病位點[4]；明麥16的親本為徐3-01和矮抗58，但其抗病基因的來源尚不清楚。上述結果顯示，相同的抗病基因在不同的品種中表現的效應不同，說明赤霉病抗性基因的表達與品種本身的遺傳背景等有關[6]，即使攜帶抗赤霉病主效基因Fhb1，該品種也不一定抗赤霉病，因此在抗赤霉病育種中不是單純的導入某1個或者2個抗病基因/QTL就能顯著提高該品種的赤霉病抗性，要同時注重遺傳背景和抗性基因/QTL的相互選擇。太麥198可能攜帶Fhb4，抗性達到中感水平，其親本為良星619和山農17，但其抗病基因的來源尚不清楚。其他中抗或中感赤霉病的品種(系)中均未檢測到Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點，推測它們可能攜帶其他抗赤霉病基因/QTL，小麥抗赤霉病基因/QTL的挖掘和機理機制的研究還有待進一步深入進行。小麥抗赤霉病屬于復雜的多基因控制性狀，本研究中僅有6個品種(系)攜帶1～3個所檢測抗病基因/QTL，因此無法用統計學方法分析基因/QTL對小麥赤霉病抗性的單位點效應或者聚合效應，下一步擬增加供試材料，選擇黃淮麥區近幾年育成的其他主栽品種繼續進行研究，深入解析遺傳背景和抗性基因的相互影響。

4 結 論

本研究于2016-2017和2017-2018兩年度分別對71個黃淮麥區的小麥品種(系)采用單花滴注接種的方法進行赤霉病抗擴展性鑒定，沒有發掘到高抗赤霉病的品種(系)，西農511、徐麥DH9、皖麥32、皖麥31、新鄉289、淮麥30、淮麥40、連麥2號、淮麥21、淮麥44、淮麥33、淮麥38、徐農029、明麥16、江麥23、淮麥36、皖麥33、偃展4110、新鄉197、新鄉280、鄭1860和太麥198對赤霉病的抗性達到中抗或中感水平。徐麥DH9和淮麥40可能同時攜帶Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點；明麥16、皖麥32可能僅攜帶QFhs.crc-2DL位點；太麥198可能僅攜帶Fhb4。研究結果可為黃淮麥區的小麥抗赤霉病育種提供遺傳資源與信息。

致謝：感謝中國農業科學院作物科學研究所夏先春研究員和董亞超技術員在KASP基因分型方面提供的技術支持。