人工合成六倍體小麥耐鹽種質資源的篩選及評價

李小康，吳崇寧，王 維，李文淑，KISHII MASAHIRO，田紀春，鄧志英

(1.山東農業大學農學院,作物生物學國家重點實驗室，小麥品質育種研究室，山東泰安 271000；2.邯鄲市農業科學院，河北邯鄲，056000；3.CIMMYT,Apdo. Postal 6-641,06600,Mexico,D.F.,Mexico.)

人口的逐漸增長以及耕地的減少不僅對農業的可持續發展造成了影響，而且對全世界的糧食安全也構成了嚴重的威脅[1]。全球約有800萬 hm2(6%)的耕地受到鹽分的影響[2]，土壤鹽漬化逐漸成為了影響小麥產量的主要因素之一[3]。小麥是我國主要糧食作物之一，在我國農業生產中占有舉足輕重的地位[4]。近年來，我國鹽漬化土壤面積不斷擴大，對農業可持續發展造成了巨大影響[5]。通過培育和篩選耐鹽性強的小麥品種(系)，可實現鹽堿地的有效利用，并成為促進糧食增產的重要途徑[6]。

芽期和苗期是小麥生長發育初期階段，小麥萌發和幼苗質量對生育期壯苗的形成影響較大。在該階段小麥對逆境脅迫比較敏感[7]，因而也是進行小麥耐鹽性鑒定的最好時期。韓冉等[8]對多個小麥品種進行不同鹽濃度梯度脅迫，對苗期的根長、苗高及最終產量進行比較分析，最終篩選出濟麥262等三個耐鹽性較好的小麥品種；陳春舟等[9]對16份小麥種質材料進行0.2 mol·L-1NaCl脅迫，通過綜合評價篩選出3份苗期耐鹽性均較高材料；彭澤等[10]對121份小麥及遠緣雜交后代進行耐鹽性鑒定，通過綜合評價苗期生理以及SOD、POD活性等指標，篩選出耐鹽性較好的5份小麥材料及8份小麥遠緣雜交后代。目前小麥耐鹽性鑒定基本以普通小麥為對象，缺乏對人工合成六倍體小麥的耐鹽性了解。人工合成六倍體小麥是四倍體硬粒小麥和粗山羊草雜交，經染色體加倍而形成的小麥類型，含有豐富的抗病、抗蟲、優質亞基、耐旱、耐寒及耐鹽等優異基因[11-13]，具有較強的抗逆性，適合作為現代分子育種的優良抗性基因的提供者，其耐鹽性值得深入研究。本研究以墨西哥國際玉米小麥改良中心提供的141份人工合成六倍體小麥為材料，利用水培法來培育小麥幼苗，以清水為對照，在小麥芽期和苗期分別進行不同濃度鹽脅迫處理(NaCl:100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1)，測定小麥芽期苗高、最大根長、胚芽鞘長以及發芽率等形態指標及苗期葉片丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量等生理生化指標，進而用主成分分析和聚類分析對試驗材料的耐鹽性進行綜合性評價，以篩選出耐鹽性較強的小麥材料，以期為耐鹽小麥新品種的培育提供新的種質材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為從墨西哥國際玉米小麥改良中心引進的141份人工合成六倍體小麥材料(編號Syn1～Syn141)。試驗于2019年春季在山東農業大學培養箱中進行，以山東省德州市農業科學院提供的抗鹽小麥品種德抗961為對照。

1.2 種子萌發試驗

試驗設置0、100、150和200 mmol·L-14個NaCl濃度處理，每個濃度設置3次重復。在發芽盒中放入大小適當的吸水紙，加入不同濃度NaCl溶液至吸水紙飽和，每個材料選取長勢均勻飽滿且無病蟲害的健康種子80粒，腹溝向下，種胚朝向一致，擺放在吸水紙上，間隔距離均勻一致，置于溫度24 ℃、光照12 h、黑暗12 h、濕度70%、光照強度20 000 lx的培養箱中培養。萌發過程中每天補水稱重兩次，測其溶液電導率，使其濃度保持穩定。其中100、150和200 mmol·L-1NaCl溶液電導率分別維持在7 366、12 188和17 071 us。培養7 d后計算其發芽率，測量苗高、根長、胚芽鞘長。

1.3 幼苗試驗

每個材料選取種子100粒，在發芽盒中放入大小適當的吸水紙，先清水培養至1葉1心期，再換至不同濃度NaCl溶液培養。NaCl濃度設置同萌發試驗，用去離子水做對照。幼苗置于溫度24 ℃、光照12 h、黑暗12 h、濕度70%、光照強度20 000 lx的培養箱中培養。培養過程中每天補充鹽溶液稱重兩次，測其溶液電導率，使其濃度保持穩定，培養5 d后取樣測定葉片丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量及地上部鮮重和干重、根鮮重和根干重，其中丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量的測定分別采用硫代巴比妥酸法、茚三酮法和蒽酮法[15-18]。并計算根冠比等指標。

鮮重根冠比=(根鮮重/地上部鮮重)×100%；干重根冠比=(根干重/地上部干重)×100%；苗含水量=(地上部鮮重-地上部干重)/苗鮮重；根含水量=(根鮮重-根干重)/根鮮重；采用霍鵬[14]的方法計算小麥各性狀相對耐鹽系數：相對耐鹽系數=(鹽堿脅迫值/對照值)×100%。

1.4 綜合評價

參考龔明的方法[19]計算各指標隸屬函數值U(Xi)：U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。Xi表示小麥材料第i個指標的觀測值，Xmin和Xmax分別表示第i個指標所有觀測值中的最小和最大值。由于MDA含量與作物耐鹽性呈負相關，因此其隸屬函數值U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。基于隸屬函數值利用主成分分析對小麥材料進行綜合評價。

1.5 數據處理

用Microsoft Excel 2019、SPSS 22及SPSS AU對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 鹽濃度對小麥芽期和苗期形態和生理指標的影響

2.1.1 鹽濃度對芽期形態指標的影響

當在清水中培養時，所有小麥材料均能夠發芽；鹽濃度為100 mmol·L-1時能夠發芽的小麥材料數占總材料數的90.78%；但當鹽濃度達到150 mmol·L-1時則發芽受到很明顯的抑制，能夠發芽的小麥材料數占總材料數的63.83%；當鹽濃度達到200 mmol·L-1時能夠發芽的小麥材料數大大降低，僅占總材料數的25.53%。其中，對照德抗961在150和200 mmol·L-1濃度下均不能發芽。因此，后續試驗只對各濃度中能發芽的小麥材料進行分析。

小麥的發芽率、苗高、最大根長、胚芽鞘長均隨著鹽濃度的增加而降低(圖1)。當鹽濃度由0 mmol·L-1升高到100 mmol·L-1時，四個性狀受影響的程度均較大；當鹽濃度升高到200 mmol·L-1，小麥的發芽率由71.08%降到 21.78%，苗高由16.09 cm降到2.7 cm，最大根長由10.3 cm降到1.00 cm，胚芽鞘長度由3.45 cm降到2.34 cm。由此可見，較高濃度的鹽脅迫會抑制小麥種子萌發和幼苗生長。

圖柱上字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2和圖3同。

2.1.2 鹽濃度對苗期生理指標和生物量的影響

人工合成六倍體小麥的葉片可溶性糖和脯氨酸含量均隨著鹽濃度的升高而上升，而德抗961葉片的可溶性糖和脯氨酸含量分別呈先降后升和上升的趨勢；所有材料的葉片丙二醛含量隨著鹽濃度的升高均呈現先升后降的趨勢，均在100 mmol·L-1鹽濃度下達到最大值；與德抗961相比，在相同鹽濃度下，人工合成六倍體小麥的可溶性糖和脯氨酸含量均較低，而丙二醛含量均較高(圖2)。這說明鹽脅迫對人工合成六倍體小麥的滲透調節和膜脂過氧化均產生影響。

圖2 鹽濃度對小麥苗期生理指標的影響

由圖3可知，人工合成六倍體小麥和德抗961的地上部鮮重和干重、根鮮重以及人工合成六倍體小麥的根干重均隨著鹽濃度的升高而降低，而德抗961的根干重隨著鹽濃度的升高呈先升后降趨勢，且在100 mmol·L-1鹽濃度下達到最大值。這進一步表明鹽脅迫對小麥幼苗生長產生明顯的抑制作用。

圖3 鹽濃度對小麥生長的影響

2.2 人工合成六倍體小麥耐鹽相關性狀的表型分析

與0 mmol·L-1處理相比，100 mmol·L-1鹽脅迫條件下，幼苗的葉片可溶性糖含量和脯氨酸含量的平均值均較高，發芽率、苗高、最大根長、胚芽鞘長、根干重、根鮮重、地上干重、地上部鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比、根含水量的平均值均較低(表1)。此外，當人工合成六倍體小麥受到鹽脅迫時，各性狀的變異程度都較明顯，其中鹽脅迫條件下根干重、根鮮重及干重根冠比的變異系數都較大，均超過80%，說明100 mmol·L-1鹽脅迫處理已對小麥材料地上部和根系的生長 發育均產生不同程度的抑制，可以用于耐鹽性 鑒定。

表1 人工合成六倍體小麥芽期和苗期形態和生理指標的表型分析

2.3 鹽脅迫條件下各性狀之間的相關性

經對性狀耐鹽系數之間的相關性分析(表2)，鹽脅迫下發芽率與苗高、最大根長、胚芽鞘長呈極顯著正相關，與鮮重根冠比呈極顯著負相關；苗高與最大根長、胚芽鞘長、地上部干重呈極顯著正相關，與鮮重根冠比呈極顯著負相關，與可溶性糖含量、地上部鮮重呈顯著正相關，與根含水量呈顯著負相關；最大根長與胚芽鞘長、可溶性糖含量呈極顯著正相關；胚芽鞘長與地上部干重呈顯著正相關，與干重根冠比呈顯著負相關，與鮮重根冠比呈極顯著負相關；地上部干重與根干重、地上部鮮重、根鮮重呈極顯著正相關，與苗含水量、干重根冠比呈極顯著負相關；根干重與地上部鮮重、根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比呈極顯著正相關，與根含水量呈極顯著負相關；地上部鮮重與根鮮重、苗含水量和根含水量呈極顯著和顯著正相關；根鮮重與根含水量、干重根冠比、鮮重根冠比呈極顯著正相關。由此可見，鹽脅迫下小麥的不同指標之間存在密切聯系，在反映耐鹽性的信息方面存在不同程度的重疊，因此需要綜合來評價。

表2 鹽脅迫條件下所測耐鹽系數之間的相關性

2.4 小麥耐鹽性的綜合評價

通過對各個指標的耐鹽系數進行主成分分析，最后將15個指標劃分成了5個綜合性指標(A1、A2、A3、A4、A5)，這5個綜合指標的特征值、貢獻率和權重見表3。這5個綜合性指標的貢獻率分別為30.504%、24.946%、10.539%、 8.993%、7.16%，累積貢獻率達到了82.142%，包含了絕大部分指標的主要信息。

表3 各綜合指標特征值、貢獻率及權重

分析得到了各因子的載荷系數(表4)，可知A1的特征值為2.941，在發芽率、苗高上有較大的載荷量，可歸類為苗高主成分。A2的特征值為2.583，在根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比上有較高載荷量，可歸為根冠比主成分。A3的特征值為2.252，在地上部干重和鮮重上有較大的載荷量，地上部干重的影響最大，可歸為地上物質主成分。A4特征值為1.503，可溶性糖上有較大的載荷量，載荷系數為0.676，歸為相容性物質主成分。A5的特征值為1.337，在丙二醛含量、根干重上有較大載荷量，根干重影響最大，可歸為根物質主成分。

表4 前5個主成分對應的載荷系數

綜上分析發現，這5個綜合性指標與小麥耐鹽性密切相關。其中發芽率、苗高、胚芽鞘長、根長、根鮮重、干重根冠比、鮮重根冠比、地上部干重、地上部鮮重、苗含水量、可溶性糖含量、根干重、丙二醛含量等在各自的綜合性指標中比重都較大，因此，可以將其作為小麥生長早期耐鹽性篩選的指標。

利用各指標耐鹽系數值、主成分載荷和權重求出各個材料的綜合評價值(D值)，并進行系統聚類分析(圖4)。按照耐鹽能力由強到弱將141份材料劃分為了四類：第一類為高耐鹽材料，共17份，主要包括Syn122、Syn124、Syn99、Syn35、Syn114、Syn127、Syn128、Syn131等，占供試材料的12.06%；第二類為耐鹽材料，共61份，主要包括Syn23、Syn117、Syn61、Syn79、Syn109、Syn140、Syn74、Syn9、Syn103等，占供試材料的43.26%；第三類為中度耐鹽材料，共48份，主要包括Syn7、Syn39、Syn96、Syn33、Syn95、Syn58、Syn91、Syn97、Syn8等，占供試材料的34.04%；第四類為鹽敏感材料，共15份，主要包括Syn14、Syn22、Syn5、Syn20、Syn10、Syn92、Syn12、Syn68、Syn11等，占供試材料的10.64%。

圖4 人工合成六倍體小麥D值系統聚類分析結果

3 討 論

鹽堿化土地造成的鹽害是由過量鹽分引起的，且通常是由高濃度的 Na+、Cl-造成的[21-22]，因而目前作物耐鹽性鑒定大多采用NaCl溶液模擬鹽脅迫[23-24]。作物生長起始階段抗逆境脅迫能力差，對逆境脅迫反應敏感且易受害，最終的產量受影響較大。小麥芽期和苗期是小麥整個生育期中最易受到鹽脅迫危害的時期，因此芽期和苗期是對小麥進行耐鹽鑒定性的重要時期[25-27]。本研究分別對人工合成六倍體小麥材料的芽期和苗期進行不同濃度的鹽脅迫，并對形態指標和生理指標進行測定分析及耐鹽性綜合評價，可以較為準確地比較不同材料之間耐鹽性的差異。彭智等[28]對321份小麥材料進行芽期和苗期耐鹽性鑒定，通過主成分分析把芽期和苗期的14個指標分別劃分成了4類綜合指標。李鳳勤等[29]對205份小麥材料進行芽期耐鹽性鑒定，通過主成分分析法將多個耐鹽指標劃分成了5類綜合指標。本研究通過主成分分析也將人工合成六倍體小麥芽期和苗期多個形態和生理指標劃分為5類綜合性指標，其結果也與前人基本一致。利用綜合評價值進一步進行聚類分析，將141份人工合成六倍體小麥材料的耐鹽性劃分成了4大類，分別為高耐型(12.06%)、耐鹽型(43.26%)、中耐型 (34.04%)和敏感型 (10.64%)。因此將主成分分析與聚類分析結合，可有效對小麥材料進行耐鹽性評價，而且直觀可靠。但不同的研究對耐鹽性的劃分不一樣。如吐爾汗等[30]通過該方法將76份新疆冬小麥品種劃分成了5大類；張巧鳳等[23]對24份小麥品種進行苗期耐鹽性鑒定，通過該方法將24份小麥品種劃分成了3大類；李鳳勤[29]對205份小麥品種進行芽期耐鹽性鑒定，通過該方法將205份小麥品種劃分成了4大類。這可能與所有材料間耐鹽性差異程度及聚類分析的具體分類距離有關。