基于16S rDNA 分析湖北半夏內生菌群結構及代謝功能

王帆帆，唐 濤，郭 杰，段媛媛，郭曉亮，游景茂

（湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000）

半夏（Pinellia ternata）為天南星科多年生草本植物，以水玉、地文之名始載于《神農本草經》，是中國著名的中藥材，具有鎮咳化痰、消腫排膿、燥濕降逆等多種功效，被廣泛應用于定咳喘膠囊、通絡軟堅青和復方半夏片各類藥劑產品中［1，2］。目前半夏主產于湖北、重慶、甘肅、安徽、四川等地，湖北優質半夏種植面積約2 000 hm2，每667 m2收入超過2 萬元，已成為湖北省江漢平原重點脫貧項目和鄉村建設主打產業，其荊半夏因粉性足、顆粒均勻等優勢，近年來已逐漸成為半夏種源核心產區，可占國內種子來源的26%以上。2019 年7 月，潛半夏入圍湖北省“一縣一品”優勢品種，成為省地標產品。但人工種植的半夏病蟲害突發率較高，部分系統性病害由于缺乏研究，呈加重態勢，且人工種植半夏品種活性成分不足，因此需要采取科學途徑提高其產量和質量，以維持半夏產業的可持續發展［3］。

研究表明，植物內生細菌廣泛存在于植物中且種類繁多，在與寄主的長期進化過程中，不僅對健康植株不造成實質性危害，同時可以促進其生長，提高植物抗逆性，防治病蟲害［4］。學者已經從白術、中華補血草、椰棗樹等藥用植物中分離到Bacillus endophyticusAMR83、Staphylococcus和Streptomyces多 種有益內生細菌［5-7］。有利于植物健康和生長的內生細菌為植物促生細菌，可通過產生生長素、酶物質及固氮途徑、解磷作用等途徑直接或間接促進植物生長［8］。植物促生細菌是具有改善植物品質、提高抗逆性和防治病蟲害等優勢的天然資源菌。關于貴州、江蘇等地半夏內生細菌多樣性分析已有報道，但湖北半夏內生細菌多樣性的詳細研究尚未報道。

本研究通過高通量測序技術，研究了湖北半夏內生細菌的多樣性及其代謝通路，進一步揭示了藥用植物半夏內生細菌的分布情況。不僅為湖北半夏與其內生細菌之間相互關系的探索奠定基礎，還為提高藥用植物半夏的產量和質量提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗所選用的植物樣品采自湖北省天門市汪場鎮湖北省農業科學院中藥材研究所半夏基地，采集健康的、長勢良好的半夏植株，取其塊莖，無菌水沖洗干凈后，快速風干，無菌條件下去除塊莖表皮，置于液氮中保存待用。

1.2 DNA 提取和PCR 擴增

對獲得的半夏塊莖樣品用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 提取試劑盒提取其微生物組總DNA。使用上游引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA），下游引物為806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對16S rDNA V3～V4 保守區基因片段進行PCR 擴增，擴增產物回收純化后進行熒光定量分析。

1.3 高通量測序分析

采用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，MiSeq 測序儀進行高通量測序，測序委托派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息學分析

使用QIIME 軟件，分別獲取樣品在門、綱、目、科、屬5 個分類水平上的組成和豐度分布表。使用GraPhlAn 工具［9］對樣品總體在各分類水平的組成構建等級樹。使用PICRUSt 工具［10］進行菌群代謝功能預測。

2 結果與分析

2.1 測序結果質量分析

湖北半夏樣品中提取的微生物組總DNA 經PCR 擴增后進行產物回收純化，回收產物熒光定量后高通量測序，對原始雙端序列進行質量篩選，獲得樣品的有效序列共39 537 條，去除宿主序列64 條。內生細菌序列長度分布在403～466 bp，長度為407 bp的序列最多，有33 868 條，其序列長度分布如圖1 所示。從序列長度的分布來看，與16S rDNA V3～V4 區序列長度吻合。

圖1 序列長度分布

2.2 細菌多樣性分析

使用R 軟件將OTU 豐度矩陣文件結果繪制成圖2。由圖2 可以直觀地看到，以97%的序列相似度作為OUT 劃分閾值，得到681 個OTUs，其中門、綱、目分類水平的OTU 數均為130，科的OTU 數為129，屬的OTU 數為121，種的OTU 數僅為41。稀疏曲線可以評判樣品的當前測序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性，如圖3 所示。圖3 樣品曲線趨于平緩，表明該測序結果已足夠反映半夏樣品所包含的絕大部分微生物，繼續增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發現的新OTU。樣品的多樣性指數分析表明，chao1 指數和ACE 指數與操作分類單元數相同，均為130，說明測序結果足夠反映湖北半夏樣品菌群豐度，香濃指數為3.02，辛普森指數僅為0.715，說明該樣品菌群多樣性較高。

圖2 OTU 劃分和分類地位鑒定結果統計

圖3 OUT 數的稀疏曲線

2.3 細菌群落組成分析

使用R 軟件將所得數據繪制成柱狀圖，以直觀地看到樣品在同一水平的分類單元數，以顏色區分各分類單元，柱子越長，該分類單元在樣品中的相對豐度越高，如圖4 所示。半夏內生細菌主要包括6 門10 綱23 目29 科45 屬，26 種。半夏的內生細菌主要歸類于Proteobacteria 門，占分析總數的97.76%，其次是Actinobacteria門，僅占1.03%。從綱水平來看，該半夏植物的內生細菌的優勢菌綱主要是Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria，所占比例分別是51.65%和46.11%。從目水平來看，該半夏內生細菌主要歸類于Rickettsiales 和Pseudomonadales，所占比例分別為49.37%和30.70%。從科水平來看，該半夏內生細菌主要歸類于Mitochondria，所占比例為49.37%；其次Pseudomonadaceae 和Burkholderiaceae，所占比例為21.49%和14.74%。與MEGAN 相比，GraPhlAn繪制的分類等級樹提供了一種從復雜的群落數據中，快速發現優勢微生物類群的方法（圖5）。分類等級樹展示了樣本總體中，從門到屬（從內圈到外圈依次排列）所有分類單元（以節點表示）的等級關系，節點大小對應于該分類單元的平均相對豐度，相對豐度前20 位的分類單元還將在圖中以字母標識（從門到屬按照從外層到內層依次排列），字母上的陰影顏色同對應節點顏色一致。

圖4 各水平的群落分類學組成和分布

圖5 基于GraPhlAn的樣品總體分類等級樹

2.4 菌群代謝功能預測

PICRUSt 能將16S rRNA 基因序列在3 種功能譜數據庫中進行預測，即KEGG、COG 和Rfam。其中，KEGG 數據庫的核心為生物代謝通路分析數據庫（KEGG PATHWAY Database，http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html），將代謝通路歸為6 大類，包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環境信息處理（Environmental Information Processing）、細胞進程（Cellular Processes）、生物體系統（Organismal Systems）和人類疾病（Human Diseases），每一類代謝通路又被進一步劃分為多個等級。如圖6 所示，代謝功能類群中，能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群；遺傳信息處理功能類群中，復制和修復功能類群的豐度最高；環境信息處理功能類群中，膜運輸功能類群的豐度最高；細胞進程功能類群中，細胞運動功能類群的豐度最高；生物系統功能類群中，內分泌系統功能類群的豐度最高；人類疾病功能類群中，傳染性疾病功能類群的豐度最高。

圖6 PICRUSt預測的KEGG 第二等級分布

3 小結與討論

2018 年公布的《古代經典名方目錄》中，半夏的藥方占首批經典名方總數的17%，是重要的傳統大宗藥材，廣泛分布于中國長江流域以及東北、華北等地區［11］。張潔等［12］通過對貴州半夏內生細菌的研究，表明其內生細菌主要歸屬于微桿菌屬、寡養單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬。張盼盼［13］通過對江蘇邳半夏內生細菌的多樣性分析，表明其內生細菌主要分布于Actinobacteria、Proteobacteria、Tenericutes、Firmicutes、Bacteroidetes、Cyanobacteria 6個門。劉建玲等［14］對陜西楊凌半夏內生菌的分離鑒定結果表明，其優勢種群為棒孢霉屬、青霉屬和鐮孢霉屬。本研究通過對湖北半夏內生細菌多樣性分析表明，該半夏樣品的優勢菌群主要歸于6 門、10綱、23 目、29 科、45 屬、26 種。在門水平上豐度最高的是Proteobacteria，在科水平上豐度較高的是Mitochondria、Pseudomonadaceae、Burkholderiaceae。由此可知，不同地區的半夏內生細菌多樣性各有差異，這可能與地方性土壤、氣候、溫度等環境條件和栽培方式有關。通過本研究可初步明確湖北半夏內生細菌的多樣性。

目前關于藥用植物內生細菌代謝功能與寄主健康生長等相關的研究較為熱門。內生細菌可通過產生植物生長素、酶等功能直接促進植物生長，同時可通過產生細胞壁裂解酶等物質減少病菌的侵入，間接促進植物生長。周佳宇等［15］從茅蒼術中分離到可產生IAA的內生細菌，Qin 等［16］從中華補血草中分離到產ACC 脫氨酶的內生細菌，均可促進植物的生長。本研究對湖北半夏內生細菌的基因功能和代謝途徑進行初步分析，結果表明代謝功能類群中的能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群，為今后研究半夏內生細菌代謝產物多樣性和生防菌的開發提供理論基礎。

半夏有效成分之一是生物堿類物質，目前已從半夏中分離出麻黃堿、葫蘆巴堿、肌苷等多種生物堿類物質。部分內生細菌在與寄主長期的進化過程中彼此相互影響，具有相似的次生代謝產物，提高寄主活性成分。蘇昊［17］從半夏體內得到多株產生物堿類的內生菌。劉建玲等［18］研究表明半夏內生細菌不僅誘導其生物堿的合成，同時可產生某些相同的生物堿。故本研究的下一步工作將對湖北半夏內生細菌代謝產物多樣性及功能進行研究，明確其作用機制，為提高半夏質量及產量提供有力支持。