4種豆科植物根際土壤真菌群落特征與土壤理化因子間相關性分析

蘇貝貝， 張 英， 道日娜

(青海大學農牧學院，三江源區高寒草地生態省部共建重點實驗室， 青海 西寧 810016)

豆科牧草是豆科飼用植物的總稱，通過固氮作用對節約草地氮資源做出貢獻，同時具有良好的飼用價值，極大地促進了草原植被的建立，對我國畜牧業的發展十分重要[1]。扁蓿豆為豆科苜蓿屬矩莢苜蓿組的多年生草本植物，廣泛分布于我國北方的典型草原、高山草原和荒漠化草原，具有較強的抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等優點，同時，富有較高的營養價值[2]。紫花苜蓿號稱“牧草之王”，其根系比較發達，擁有較好的適應能力、能夠防風固沙、改良土壤等多種特性[3]。紅豆草營養豐富，含有大量縮合單寧，牲畜喜食且不得膨脹病，被譽為“牧草皇后”[4]。蠶豆俗稱佛豆、胡豆、寒豆等，屬越年生或一年生豆科野豌豆屬草本植物，富含蛋白質、膳食纖維、微量元素等營養物質[5]。

土壤是豆科牧草營養吸收和生長發育的重要場所，土壤質量的好壞直接或間接影響牧草品質與產量。目前，對豆科植物根際土壤生態質量的研究，主要集中于微生物量、土壤養分、微生物活性及可培養真菌的初步分類等[6-9]方面，但從土壤微生物群落結構角度探討豆科植物的研究相對較少[10]。土壤微生物是土壤生態環境中最為重要且對環境變化極其敏感的生物活性因子，對土壤生態系統的健康狀況與植被的生長發育都會產生重要影響[11]。真菌作為微生物區系的主要成員，具有分解有機質，為植物提供養分的功能，是土壤生態系統是否健康的指示物[12]。近年來，對土壤真菌群落結構和功能的探究受到了學者們的高度關注。牟紅霞等[13]研究發現，隨著種植年限的變化，土壤真菌群落變化表現為先減小后增大的變化趨勢，且與土壤理化性質具有顯著相關關系，pH值、速效氮和有機碳是影響紫花苜蓿土壤真菌群落組成的主要因子。劉鳳紅[14]研究表明，藍莓系內生真菌的群落組成和結構因其品種的不同而存在一定差異，且各菌屬在不同品種藍莓根系內的優勢度也不同。

高寒地區的自然條件較為特殊，海拔高，氣候寒冷干旱，生態環境脆弱，挖掘極端生境下的土壤真菌群落結構特征是未來研究的重要方向。前人主要通過探索培養微生物、PCR-DGGE、16S rRNA基因文庫構建技術來了解土壤微生物群落結構[15-16]。這些方法存在通量低、信息量少，并不能全面反應出土壤微生物的物種結構及其豐度[17]。因此，本研究采用Illumina HiSeq PE250高通量測序技術對4種豆科牧草根際土壤進行測序，全面反應土壤中真菌的多樣性，探明4種豆科牧草根際土壤真菌群落結構對土壤理化性質的響應，旨在為高寒地區豆科牧草根際土壤真菌多樣性的深入研究提供基礎數據理論依據，對維護高寒草地生態系統平衡有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于青海省牧草良種繁育場(N 35°15′28″，E 100°39′16″)，平均海拔高程3 220 m，年平均氣溫為0.2℃，全年≥0℃的活動積溫為1 503℃，全年無絕對無霜期，年平均降水量為430.0 mm，年平均蒸發量為1 352.5 mm。該地區海拔高，冬春干旱，多風而寒冷、夏季涼爽，雨熱同季，適合牧草生長。

1.2 樣地設置及土樣采集

在2019年4月20日播4種豆科植物草種，種植面積為5 m×8 m，條播，行距為40 cm，每個處理田進行3次重復，播種量分別為扁蓿豆Medicagoruthenicu(樣品編號TDB)24 kg·hm-2、紫花苜蓿Medicagosativa(樣品編號TDZ)22.5 kg·hm-2、紅豆草Onobrychisviciifolia(樣品編號TDH)30 kg·hm-2、蠶豆Viciafaba(樣品編號TDC)220 kg·hm-2，隨機區組試驗設計如圖1所示。土壤樣品采集時間為2019年8月20日，具體采集方法如下：采用5點取樣法取樣，使用土鉆采取0～20 cm植物根系及土壤樣品，抖落根系大塊土壤，收集根上0～5 mm的土壤作為根際土[18]，立即裝入無菌樣品采集袋，所有樣品在低溫條件下帶回實驗室，樣品分為兩份，一份自然風干過2 mm篩用于土壤理化性質的測定，另外一份-80℃冰箱保存，用于土壤微生物總DNA提取。

圖1 隨機區組試驗設計圖

1.3 測定指標與方法

1.3.1土壤理化指標 土壤理化性質的測定方法如下[19]：利用酸度計電位法測定土壤pH值；利用氯化鉀浸提-分光光度計法測定土壤速效氮含量；利用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量；利用醋酸銨浸提-火焰光度計法測定土壤速效鉀含量；利用納氏比色法測定土壤全氮含量的測定采用；利用鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；利用火焰光度計法測定全鉀含量；利用高溫外熱重鉻酸鉀氧化—容量法測定有機質含量。

1.3.2土壤總DNA提取及ITS基因擴增 采用OMEGA土壤DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取豆科植物根際土壤樣品中的微生物基因組DNA，為了降低實驗誤差，每個樣品重復3次。采用Illumina HiSeq PE250測序平臺的通用引物對真菌ITS1區域進行PCR擴增，引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR擴增條件參照Miao等[20]方法。將電泳檢測合格的PCR產物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后對Reads進行拼接[21]得到原始Tags數據(Raw Tags)；對原始測序數據進行質量過濾并去除嵌合體序列，進而得到優質Tags數據；在相似性97%的水平上對序列進行聚類，用Mothur[22]方法與SILVA軟件的SSUrRNA數據庫進行物種注釋(閾值0.8～1.0)；采用PyNAST軟件[23]與GreenGene數據庫中數據信息進行多序列比對，最后對測序數據進行標準化處理，進一步進行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等來挖掘樣品之間的差異。通過RStudio軟件繪制熱圖，采用非加權配對平均法進行層次聚類繪制系統發育樹。

1.5 數據分析

所有數據經過Excel 2013處理，采用SPSS 21.0軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。土壤理化指標與真菌群落之間的關系，采用Pearson相關系數法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

4種不同豆科植物根際土壤理化性特征測定結果如表1所示，結果表明4種豆科植物根際土壤的pH值在8.02～8.25之間，其差異顯著(P<0.05)，全氮含量變化范圍為1.1～2.79 g·kg-1，全磷含量范圍在1.96～3.44 g·kg-1之間，全鉀含量范圍為23.85～24.81 g·kg-1，TDC樣品和其他3個樣品全鉀含量差異顯著，速效氮含量范圍為78～187 mg·kg-1，速效磷含量范圍為19.3～75.2 mg·kg-1，速效鉀含量范圍為78～168 mg·kg-1，有機質含量范圍為16.39～41.73 g·kg-1，TDB的土壤速效氮、速效磷和速效鉀，以及有機質含量均遠遠小于其他3個樣品。

表1 4種豆科植物根際土壤理化因子特征

2.2 土壤真菌群落豐度與Alpha多樣性分析

通過對4個土壤樣品進行高通量測序，共得到267 532條有效序列，序列長度相對集中，平均長度分別為260 bp，256 bp，238 bp，243 bp，聚類共得到966個OTUs。各樣品測序覆蓋度均在99.9%以上，并且趨于平緩的稀釋曲線，說明本研究測序數據合具有可靠性，能夠準確提供土壤真菌群落的真實信息(圖2)。如表2所示，各樣品真菌群落豐富度指數(Chao1指數)依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(Shannon-Wiener)指數依次為TDC>TDB>TDH>TDZ。在97%的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU個數，如圖3所示，所有樣品中共有OTUs數目為61個，其中TDB，TDC，TDH，TDZ所特有的OTUs數目分別為44，50，26和19個。

表2 4種豆科植物根際土壤樣品序列數統計、豐富度與多樣性指數

圖2 樣品稀釋曲線

圖3 樣品韋恩圖

2.3 土壤真菌群落分布特征

2.3.1門水平上的組成 如圖4所示，在4種豆科植物根際土壤中，各樣地土壤真菌分屬于9個門，相對豐度>1%的菌群分別為子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、絲足蟲門(Cercozoa)、油壺菌門(Olpidiomycpta)、球囊菌門(Glomeromycota)、Aphelidiomycota、毛霉門(Mucoromycota)。其中，子囊菌門(Ascomycota)在4組土樣中的相對豐度為39.52%～84.51%，是最優勢菌門，遠遠大于次優勢菌門——被孢霉門(Mortierellomycota)，相對豐度為6.94%～24.65%；各組土樣在門分類水平上的菌群落豐度分別為：子囊菌門(Ascomycota)在各組土樣中相對豐度高低為TDZ>TDH>TDC>TDB；被孢霉門(Mortierellomycota)在各組土樣中相對豐度高低為TDC>TDB>TDH>TDZ。

圖4 門分類水平下的真菌群落相對豐度

2.3.2屬水平上的組成 如圖5所示，在各樣地中真菌在屬分類水平上，相對豐度>1%的分別為四枝孢屬(Tetracladium)、被孢霉屬(Mortierella)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、小畫線殼屬(Monographella)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、小鬼傘屬(Coprinellus)、油壺菌屬(Olpidium)、鐮刀霉屬(Fusarium)。其中，在TDB土樣中，小不整球殼屬(Plectosphaerella)為最優勢屬，相對豐度為23.23%；被孢霉屬(Mortierella)為次優勢屬，相對豐度為14.64%。TDC土樣中，被孢霉屬(Mortierella)為最優勢屬，相對豐度為23.93%；次優勢屬為四枝孢屬(Tetracladium)，相對豐度為4.75%。然而，在TDH土樣中，四枝孢屬(Tetracladium)為最優勢屬，相對豐度為42.29%；次優勢屬為被孢霉屬(Mortierella)，相對豐度為6.93%。同樣，在TDZ土樣中，四枝孢屬(Tetracladium)為最優勢屬，相對豐度為6.86%；次優勢屬為被孢霉屬(Mortierella)，相對豐度為6.77%。

圖5 屬分類水平下的真菌群落相對豐度

2.4 Beta多樣性分析

通過以Rstudio軟件的P-heatmap包繪制聚類熱圖，從聚類中可根據顏色梯度的變化直觀看出兩兩樣品間的差異性。聚類結果如圖6所示，TDZ樣品和TDC樣品的真菌群落組成及豐度差異最小，而和TDB樣品的真菌群落組成及豐度差異最大。

圖6 豆科牧草根際土壤樣品加權UniFrac的heatmap圖

基于Beta多樣性分析得到的四種距離矩陣，通過R語言工具采用非加權配對平均法(UPGMA)對樣品進行層次聚類，以判斷各樣品間物種組成的相似性。從圖7中可以看出TDZ樣品和TDC樣品的真菌組成及豐度相似性較高，而和TDB樣品的真菌群落結構差異較大。

圖7 基于OTU的豆科牧草根際土壤樣品樹狀聚類圖

2.5 土壤理化性質與真菌優勢類群的相關性

土壤中微生物物種豐度與土壤理化性質關系密切，門水平豐度較高物種與土壤理化相關性分析表明(表3)。土壤pH值與子囊菌門呈負相關，與其他理化因子呈正相關。土壤全氮、速效磷、有機質與子囊菌門、壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈正相關；與絲足蟲門、油壺菌門、毛霉門呈極顯著負相關(P<0.01)；與被孢霉門、擔子菌門呈負相關。土壤全磷與子囊菌門、被孢霉門、壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈正相關；與油壺菌門呈顯著負相關(P<0.05)；與擔子菌門、絲足蟲門、毛霉門呈負相關。土壤全鉀與壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈極顯著正相關(P<0.01)；與被孢霉門呈負相關；與子囊菌門、擔子菌門、絲足蟲門、油壺菌門、毛霉門呈負相關。土壤速效氮、速效鉀與子囊菌門呈負相關；與其他理化因子負相關。

表3 門水平物種與土壤理化性質的相關性

2.6 土壤理化性質與真菌多樣性的相關性

對4種豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質進行相關性分析，結果表明(表4)，土壤真菌群落豐富度Chao1指數與土壤全磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與土壤有機質含量呈顯著正相關(P<0.05)；土壤真菌群落多樣性指數Shannon與土壤pH值、全磷、全鉀、有機質含量呈正相關，與土壤全氮、速效氮、速效磷、速效鉀含量呈負相關。

表4 不同豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質的相關性

3 討論

土壤微生物不僅可以調節植物群落的結構和多樣性，在一定程度上還影響著植物與微生物群落間的互相適應作用[24-25]。真菌能夠對生態系統的健康變化做出敏銳反應，并且積極促進碳、氮在土壤中的轉化利用，尤其是在植物有機體分化的前期過程中，真菌比細菌和放線菌更具活性[26]。

有研究發現土壤pH值是影響真菌群落結構的重要環境因子，對真菌的生長和繁殖具有顯著影響[27]。當土壤有機質含量超過其所能承受的閾值時，真菌多樣性就會降低[28]。張雪等[29]研究表明，艾比湖濕地6種鹽生植物根際土壤真菌群落多樣性及豐富度存在差異。結合本研究對同一地區種植的4種豆科牧草根際土壤真菌進行高通量測序分析，Alpha多樣性分析結果表明，各樣地真菌群落豐富度指數(Chao1指數)依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(Shannon-Wiener指數)依次為TDC>TDB>TDH>TDZ。β多樣性分析結果表明，TDZ樣品和TDC樣品的真菌群落組成及豐度差異最小，而和TDB樣品的真菌群落組成及豐度差異最大。李金前等[30]研究發現，3種園林植物土壤中的真菌數量和群落結構差異顯著。這與本研究中同一地區不同種豆科植物根際土壤真菌群落結構差異顯著結果相一致，土壤環境是造成牧草根際土壤真菌群落多樣性差異的原因。

優勢菌是決定微生物群落平衡的重要因素，能夠影響微生物群落的組成和結構。蘇小惠等[31]對同一地區不同苧麻品種根際微生物多樣性群落結構進行了分析，結果表明，真菌主要以子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為主。趙興麗等[32]對不同品種茶樹根際土壤真菌群落多樣性及結構特征進行研究，試驗結果顯示，擔子菌門、子囊菌門和接合菌門為優勢真菌群。汪焱等[33]對高寒區不同地域燕麥根際土壤微生物多樣性進行研究，結果指出，真菌主要以子囊菌門，球灰霉菌門，擔子菌門，壺菌門，油壺菌門，球囊菌門子為主，這與本研究結果相似，但群落組成相對豐度不同。張俊忠等[34]研究結果表明，不同草地類型土壤真菌的構成相似，但是土壤真菌的數量、種類、結構組成不同。結合本研究，4個土壤樣品中的真菌群落在門水平上，主要以子囊菌門最為豐富，其次為被孢霉門、擔子菌門。進一步屬水平上分析，小不整球殼屬(Plectospharella)在TDB土樣中最為豐富，相對豐度為23.23%；TDC土樣中，被孢霉屬為最優勢屬，相對豐度為23.93%；四枝孢屬在TDH、TDZ樣地中最豐富，相對豐度分別為42.29%，6.86%。從門和屬分類水平上可以明顯看出同一地區栽培牧草土壤微生物群落組成基本一致，但4種豆科植物的土壤微生物群落組成豐度存在差異。

真菌對季節變化、土壤理化性質、植被類型等的響應各有不同，而土壤環境因子是影響土壤真菌多樣性的主要因素。Wang等[35]比較了南極洲菲爾德斯Fildes地區4種不同種類土壤的微生物多樣性和菌群組成，發現影響土壤微生物菌群結構最顯著的因素為pH值、磷酸鹽、有機碳、有機氮含量。Hazard等[36]研究顯示，土壤有機質含量會對土壤真菌群落結構存在重大影響。Jansa等[37]研究表明施磷對提高土壤真菌的多樣性具有一定的作用。李海云等[38]研究發現土壤速效鉀、全氮、速效氮、有機質和有機碳是祁連山不同退化高寒草地土壤真菌群落分布的主要驅動因子。植物根系的健康狀態是植物、土壤物理環境和化學環境以及土壤中微生物(病原體本身以及其他微生物)之間復雜的相互作用的結果[39]。通過分析真菌多樣性與土壤環境因子的關系，可以間接反映土壤是否健康，本研究相關性分析表明，4種豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤全磷、速效磷、全氮、全鉀、速效氮、速效鉀、有機質的含量及土壤pH值間存在一定的相關性，其中重要驅動因素是土壤全氮、全磷、速效磷和有機質，這說明真菌對環境的適應能力不同，對環境因子的改變比較敏感，從而導致真菌群落結構發生變化。各種環境因子與土壤微生物的相互作用機制是復雜的，因此，探究植物根際土壤微生物和土壤理化性質之間的關系對高寒地區的植物資源利用和經濟發展有重要的意義。

4 結論

4種豆科植物根際土壤理化性質間具有顯著差異，且與扁蓿豆樣地相比，蠶豆、紅豆草、紫花苜蓿3樣地土壤理化性質更為相似。通過Illumina HiSeq高通量測序技術，共得到267 532條有效序列，聚類共得到966個OTUs；4種豆科植物根際土壤真菌群落豐富度指數(Chao1指數)依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(Shannon-Wiener)指數依次為TDC>TDB>TDH>TDZ；Beta多樣性分析表明，蠶豆與紫花苜蓿根際土壤真菌多樣性相似度較高，與扁蓿豆差異性較大。通過相關性分析，土壤全氮、全磷、全鉀、速效磷和有機質是土壤真菌群落分布的主要影響因子。