南荻MlNAC2基因差異表達(dá)與耐鹽生理響應(yīng)的相關(guān)性分析

萬 婷, 段鈞譯, 李 蒙, 陳智勇

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.芒屬植物生態(tài)應(yīng)用技術(shù)湖南省工程實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙410128；3.國(guó)家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心湖南分中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 4.湖南省蠶桑科學(xué)研究所， 湖南 長(zhǎng)沙410127)

芒屬植物(Miscanthusspp.)為禾本科(Poaceae)C4作物，俗稱芒草，全世界共有約14個(gè)種，其中芒(M.sinensis)、五節(jié)芒(M．floridulus)、荻(M．sacchariflorus)和南荻(M．lutarioriparius)是最具開發(fā)潛力的4個(gè)種。南荻是我國(guó)特有種，具有光合效率高、生物質(zhì)產(chǎn)量大、抗逆性強(qiáng)、對(duì)生態(tài)環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[1]，一次種植可長(zhǎng)期收獲[2]，在作為生物煉制原料、生物能源、生態(tài)修復(fù)和固碳減排方面均具有重要作用[3]。中國(guó)鹽堿地總面積3.6×106公頃，濱海鹽堿土面積1×106公頃[4]，在濱海灘涂及鹽堿地種植芒草等新型作物，不僅可以改良土壤和防止荒漠化，同時(shí)還能滿足社會(huì)對(duì)材料、能源和環(huán)境的需求。因此，培育生物產(chǎn)量高且耐鹽的新種質(zhì)是芒屬植物育種研究的重點(diǎn)，而發(fā)掘耐鹽基因則是其中的關(guān)鍵。

當(dāng)植物生長(zhǎng)在鹽漬化土地上時(shí)，自身可以感知到鹽漬化脅迫信號(hào)，然后通過滲透脅迫，激素類信號(hào)調(diào)節(jié)以及離子脅迫等[5]不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑把信號(hào)傳遞給相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，相關(guān)基因開始表達(dá)，獲得一系列表達(dá)產(chǎn)物，以此來降低鹽漬化帶來的危害，提高植物自身的存活率[6]。NAC(NAM，ATAF and CUC2)就是其中一種轉(zhuǎn)錄因子，其命名取自矮牽牛(Petuniahybrida)的NAM(No apical meristem)基因、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ATAF1/2(Arabidopsis transcription activation factor)基因和CUC2 (Cup-shaped cotyledon)基因的首字母[7]，它是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子[8]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程以及逆境中發(fā)揮作用，是植物里最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[9]。NAC家族成員很多，發(fā)揮的作用也很廣泛，為植物在逆境下的生存提供了巨大的幫助[10]。NAC轉(zhuǎn)錄因子C端具有高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，它的特點(diǎn)是重復(fù)出現(xiàn)一些簡(jiǎn)單的氨基酸，如脯氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸，主要作用是轉(zhuǎn)錄激活或阻遏[11]。本課題組前期研究中，克隆了南荻的MlNAC2基因，并對(duì)其表達(dá)模式和特性、基因功能進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)南荻中的MlNAC2基因在葉片和葉鞘中表達(dá)量較高，并且能夠響應(yīng)高鹽、干旱、低溫的脅迫，MlNAC2在擬南芥中的過表達(dá)提高了擬南芥的抗旱性[12]。但鹽脅迫下MlNAC2基因的表達(dá)會(huì)引發(fā)植物體哪些生理響應(yīng)卻并不清楚。基于此，以南荻多倍體為試驗(yàn)材料，對(duì)鹽脅迫下MlNAC2基因差異表達(dá)與耐鹽生理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，為耐鹽種質(zhì)的挖掘和高效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

南荻三倍體材料L1～L10，由課題組前期培育，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃(28°11′N，113°04′E)；母本P1，采自江蘇南京(32°04′N，118°50′E)；奇崗G為北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心(39°56′N，116°16′E)范希峰博士所贈(zèng)；P1和G現(xiàn)保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考陳靜波等[13]的方法，取南荻的地下根狀莖在煉苗室培養(yǎng)。地下莖發(fā)芽后，將其種植于底部帶孔(4個(gè)直徑4 mm的小孔)的塑料缽(約0.6 L)中，用洗凈的河沙作為基質(zhì)，每個(gè)基因型種植40缽，每缽1～2株苗，然后置于育苗盤(54 cm×28 cm×6 cm)上，每個(gè)育苗盤內(nèi)裝1/2 Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液[14]3 L。培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間8 h。待試驗(yàn)材料長(zhǎng)至20 cm時(shí)，在距沙面5 cm處將其打頂處理，1個(gè)月后不同基因型材料各選擇24缽長(zhǎng)勢(shì)均一的植株進(jìn)行NaCl脅迫，NaCl濃度為0,0.2%,0.5%和0.8%，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。在鹽脅迫的第6天開始測(cè)量MlNAC2基因相對(duì)表達(dá)量，4天為一周期。測(cè)量4次，到第3次時(shí)各試驗(yàn)材料單株的葉片出現(xiàn)不同程度的發(fā)黃萎蔫現(xiàn)象，并且有單株大量死亡，因此，選擇MlNAC2基因相對(duì)表達(dá)量變化最顯著的第2次測(cè)量結(jié)果分析其與當(dāng)天生理指標(biāo)的相關(guān)性。

1.3 材料存活率測(cè)定

材料葉片萎蔫至整株葉片總數(shù)90%以上，難以在該濃度NaCl脅迫下繼續(xù)生長(zhǎng)，即判斷其死亡。存活率=存活株數(shù)/總株數(shù)×100%。

1.4 MlNAC2基因的表達(dá)量測(cè)定

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[15]。引物設(shè)計(jì)與合成：在GenBank上獲取目的基因mRNA的全序列(NCBI:KM017002)，選定內(nèi)參基因?yàn)楹颂求w18S基因[16]，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物的序列，獲得引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR所用引物

PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各0.5 ul(20 pmol·μL-1)，cDNA1 uL，PCR反應(yīng)mix12.5 uL，用雙蒸水定容至25 uL。PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。用7500熒光定量PCR儀來選擇熔解曲線的程序。通過儀器的分析軟件來獲取熔解曲線，待程序結(jié)束后進(jìn)行分析。基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算，其中ΔΔCT = CT待測(cè)樣本(目的基因-內(nèi)參基因)— CT校準(zhǔn)樣本(目的基因—內(nèi)參基因)。本試驗(yàn)中基因表達(dá)量與對(duì)照相比差別在3倍以上時(shí)才認(rèn)定為有明顯差異。

1.5 相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定

采用丙酮乙醇混合浸提法[17]測(cè)定葉綠素含量；使用便攜式光合速率儀(Li-6400)測(cè)定被試材料的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度，光合速率儀使用的固定的紅藍(lán)光源的光量子密度為1 200 μmol·m-2·s-1[18]；采用硫代巴比妥酸法[19]測(cè)定丙二醛含量；茚三酮顯色法[20]測(cè)定脯氨酸含量；氮藍(lán)四唑光還原法[21]測(cè)定超氧化物歧化酶含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel進(jìn)行圖表繪制，SPSS 22 進(jìn)行ANOVA檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下試驗(yàn)材料的存活率

各試驗(yàn)材料NaCl脅迫18天后的存活率如表2[22]：

表2 各試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下存活率[22]

2.2 NaCl脅迫下MlNAC2基因表達(dá)量

由圖1A可知：在NaCl脅迫開始的第6天，僅L3,L7,L9的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)3倍以上變化，其他材料的相對(duì)表達(dá)量均在3倍以內(nèi)。第10天的MlNAC2基因相對(duì)表達(dá)量如圖1B，材料L6,L7,L9和P1的MlNAC2基因表達(dá)量整體出現(xiàn)大幅度上調(diào)，上調(diào)量多在3倍以上；L6在0.5%,0.8%NaCl脅迫下，L9在0.2%,0.5%,0.8%NaCl脅迫下的表達(dá)量上調(diào)了10倍以上。脅迫第14天，L4,L5開始出現(xiàn)單株大量死亡，故這兩種基因型數(shù)據(jù)不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其他材料的MlNAC2基因相對(duì)表達(dá)量如圖1C所示，差異不如第10天顯著，但L6,L9響應(yīng)仍較其他材料積極。脅迫到第18天，如圖1D所示，L2在0.8%，L3在0.2%,0.5%，L9在0.2%,0.5%,0.8%，P1在0.5%,0.8%，G在0.2%的NaCl脅迫下上調(diào)了3倍以上的表達(dá)量。4次測(cè)量中，L2,L6,L9,P1的MlNAC2基因響應(yīng)較積極，出現(xiàn)了較對(duì)照提高10倍以上的表達(dá)量；而其它材料L1,L5,L8,L10無明顯差異，變化量都在3倍以內(nèi)。

圖1 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的MlNAC2基因表達(dá)量

2.3 NaCl脅迫下各試驗(yàn)材料生理響應(yīng)

2.3.1葉綠素含量 從圖2中可以看出，L4,L5,L10的葉綠素含量在無脅迫時(shí)偏低；與之相反，L3,L7,P1的葉綠素含量無脅迫時(shí)在所有材料中最高；不同試驗(yàn)材料之間的葉綠素含量差異較大，L3是L5的7.91倍。在不同濃度的鹽脅迫下，葉綠素含量的變化出現(xiàn)不同情況，材料L6,L9,P1在各濃度脅迫下葉綠素含量均高于對(duì)照，L1,L3,L4均低于對(duì)照。在0.2%脅迫下，材料L6,L8,L9,P1顯著增加了葉綠素含量；在0.8%脅迫下，葉綠素含量最高的材料為L(zhǎng)6,L7,L8,L9,分別為2.942,2.852,2.814和2.753 mg·g-1。材料L2,L4,P1的葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的增加逐漸降低。各試驗(yàn)材料的葉綠素含量在不同濃度之間差異顯著(P<0.05)。

圖2 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的葉綠素含量

2.3.2凈光合速率 圖3顯示，NaCl脅迫的第10天，0.2%NaCl脅迫下，材料L2,L4,L5的凈光合速率與對(duì)照相比有不同程度的增加，而其他材料的凈光合速率都降低了。除L6,L10，其他試驗(yàn)材料在0.8%NaCl處理下的凈光合速率較對(duì)照均有不同程度增加。材料L1,L2,L4,L5,L9和G在0.8% NaCl脅迫下凈光合速率的值最高，材料L3,L7,L8,L10和P1凈光合速率的最高值出現(xiàn)在NaCl濃度為0.5%時(shí)。各試驗(yàn)材料的凈光合速率在不同濃度之間差異顯著(P<0.05)。

圖3 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的凈光合速率

2.3.3氣孔導(dǎo)度 由圖4可知，試驗(yàn)進(jìn)行到第10天，各試驗(yàn)材料在0.8% NaCl脅迫下氣孔導(dǎo)度多數(shù)出現(xiàn)大幅度升高。材料L1～L5,L9,G最大值出現(xiàn)在0.8%NaCl脅迫下，L6,L7,L8,P1的最大值出現(xiàn)在0.5%NaCl脅迫下，而L10的氣孔導(dǎo)度在各濃度的脅迫下均較對(duì)照低。各試驗(yàn)材料的氣孔導(dǎo)度在不同濃度之間差異顯著(P<0.05)。

圖4 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的氣孔導(dǎo)度

2.3.4丙二醛含量 由圖5可知，試驗(yàn)第10天，各濃度NaCl脅迫下，材料L3,L8,G的丙二醛含量與對(duì)照相比無顯著差異，L7則比對(duì)照要低。其他材料丙二醛含量與對(duì)照相比多有顯著增加，L2,L6最高值出現(xiàn)在0.2%NaCl脅迫下，L10最高值出現(xiàn)在0.5%NaCl脅迫下，L1,L4,L5,L9,P1最高值出現(xiàn)在0.8%NaCl脅迫下。

圖5 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的丙二醛含量

2.3.5脯氨酸含量 NaCl脅迫的第10天，脯氨酸含量多數(shù)都有不同程度的升高(圖6)，L2,L3,L4,L7,L9的最高值出現(xiàn)在0.8%NaCl脅迫下，其中L2,L3,L7較對(duì)照增加了20倍以上；材料L1和G的最高值出現(xiàn)在0.5%NaCl脅迫下；材料L5,L6,L8,L10和P1的最高值出現(xiàn)在0.2%NaCl脅迫下，其中，L6在0.5%NaCl脅迫下脯氨酸含量較對(duì)照出現(xiàn)顯著降低。各試驗(yàn)材料的脯氨酸含量在不同濃度之間差異顯著(P<0.05)。

圖6 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的脯氨酸含量

2.3.6超氧化物歧化酶活性 由圖7可知，試驗(yàn)第10天，L3,P1的最高值出現(xiàn)在0.8%NaCl脅迫下；L2,L5,L6,L9的最高值出現(xiàn)在0.5%NaCl脅迫下，其中L5的超氧化物歧化酶活性在0.2%,0.8%NaCl脅迫下較對(duì)照出現(xiàn)大幅降低；L1,L7,L8,L10的值在0.2%NaCl脅迫下最高，但L7在不同濃度之間差異均不顯著；而L4,G的值在無脅迫條件下最高，鹽脅迫下出現(xiàn)小幅降低。

圖7 試驗(yàn)材料在不同濃度NaCl脅迫下的超氧化物歧化酶活性

2.4 NaCl脅迫下不同試驗(yàn)材料MlNAC2基因差異表達(dá)與不同生理響應(yīng)的相關(guān)性

從表3可得，NaCl脅迫的第10天，L6,L8,L9和G的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均與MlNAC2基因表達(dá)量相關(guān)，材料L6,L9和P1的葉綠素含量與MlNAC2基因表達(dá)量顯著相關(guān)，材料L8和L9的丙二醛含量與MlNAC2基因表達(dá)量相關(guān)，材料L9和P1的脯氨酸含量與MlNAC2基因表達(dá)量極顯著相關(guān)；其中L9的各生理響應(yīng)中除了超氧化物歧化酶活性之外，其他生理響應(yīng)均與其MlNAC2基因表達(dá)量顯著或極顯著相關(guān)。

表3 NaCl脅迫第10天時(shí)各試驗(yàn)材料MlNAC2基因與各生理響應(yīng)之間的相關(guān)關(guān)系

3 討論

3.1 鹽脅迫下各試驗(yàn)材料MlNAC2基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子的瞬時(shí)表達(dá)與脅迫時(shí)長(zhǎng)、植株的瞬時(shí)的生理活動(dòng)均有復(fù)雜的關(guān)系，且往往不會(huì)單一調(diào)控某個(gè)通路，而是與其他調(diào)控通路聯(lián)合作用。吉璐[23]的研究表明，南荻葉片中MlNAC2基因可響應(yīng)多種脅迫，并且受鹽脅迫和MeJA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，該基因很可能在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，并參與了多種調(diào)控。本試驗(yàn)在4次測(cè)量中，不同基因型材料MlNAC2基因表達(dá)量變化程度不一，但多數(shù)較對(duì)照有明顯增加。鹽脅迫第10天時(shí)基因型L9在0.8%NaCl脅迫下MlNAC2基因表達(dá)量超過對(duì)照27倍，且在4次測(cè)量中一直處于上調(diào)狀態(tài)，與此同時(shí)L9的各個(gè)生理響應(yīng)指標(biāo)都較積極；而基因型L8的MlNAC2基因的表達(dá)量在鹽脅迫下沒有顯著上調(diào)，L8的各個(gè)生理指標(biāo)相應(yīng)也較穩(wěn)定。本課題組前期研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下，L8對(duì)Ca2+，Mg2+的吸收能力明顯高于其他材料[22]。由此推測(cè)，L8可能通過其他調(diào)控離子吸收能力的基因表達(dá)上調(diào)來響應(yīng)鹽脅迫。

3.2 鹽脅迫下各試驗(yàn)材料的生理響應(yīng)

光合作用是植物生長(zhǎng)獲取能量的重要方式，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)[24]。因此，葉片中葉綠素含量及其變化一定程度上可以反映鹽脅迫下植物維持光合作用的能力。本試驗(yàn)中，L4,L5在無脅迫的條件下本身的葉綠素含量與其他材料相比就比較低，其存活率在所有試驗(yàn)材料中也是最低的；并且隨著鹽脅迫濃度的增加，存活率較低的材料L2,L4葉綠素含量呈連續(xù)顯著降低的趨勢(shì)，這與張景云等[25]對(duì)馬鈴薯的耐鹽性研究結(jié)論一致。在脅迫初期，植物會(huì)促進(jìn)自身葉綠素的合成以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[26]。本試驗(yàn)中在低鹽脅迫下，存活率較高的材料L6,L8,L9,P1與對(duì)照相比均顯著增加了葉綠素含量以提高鹽脅迫能力；并且在高鹽脅迫下，這幾個(gè)材料的葉綠素含量仍然能夠保持較高水平。

低鹽脅迫下，試驗(yàn)材料凈光合速率大都有所降低，表明低鹽脅迫下南荻可通過降低光合效率以耐受鹽脅迫；但材料L2,L4,L5低鹽脅迫下凈光合速率較對(duì)照有不同程度增加，并且這3個(gè)基因型對(duì)照植株的凈光合速率較其它材料低，這可能是這3個(gè)基因型對(duì)照植株的葉綠素含量偏低，導(dǎo)致低鹽脅迫下就開始提高光合效率以耐受鹽脅迫。本試驗(yàn)中葉綠素含量與凈光合速率出現(xiàn)不一致的情況，這可能是由于部分植株抵抗鹽脅迫消耗了大量能量導(dǎo)致呼吸作用增加，凈光合速率較對(duì)照降低。有研究表明[27]，中國(guó)特有品種南荻的耐旱能力高于芒和五節(jié)芒，主要?dú)w因于其較高的光合速率與水分利用效率。在本試驗(yàn)中，南荻各試驗(yàn)材料在中高度鹽脅迫下也同樣能保持較高的凈光合速率。在高鹽脅迫下，各材料的凈光合速率較對(duì)照大都會(huì)有不同程度的升高，并且與氣孔導(dǎo)度的變化呈正相關(guān)，表明此時(shí)南荻凈光合速率的脅迫效應(yīng)很大程度上來源于氣孔因素限制；并且在高鹽脅迫下，南荻仍可以有效調(diào)節(jié)和維持自身氣孔導(dǎo)度，維持其光合系統(tǒng)的活性以耐受高鹽脅迫，這與宗俊勤等[28]的研究一致。

丙二醛含量作為衡量脂類物質(zhì)過氧化水平的指標(biāo)，可以反映生物膜脂過氧化強(qiáng)弱和細(xì)胞膜破壞程度，目前已被廣泛用作脅迫條件下生物膜受活性氧(Reactive oxygen species，ROS)氧化損傷的標(biāo)志物[29]。本試驗(yàn)中，多數(shù)試驗(yàn)材料在NaCl脅迫下丙二醛含量較對(duì)照組有不同程度的提高，丙二醛含量最高的三個(gè)材料L1,L4,L5均是在高濃度脅迫下丙二醛含量出現(xiàn)急劇增加，說明此時(shí)這些材料開始出現(xiàn)了生物膜的響應(yīng)和損傷；而存活率較高的材料L7,L8等的丙二醛含量在各個(gè)濃度的NaCl脅迫下與對(duì)照相比無顯著差異，說明此時(shí)試驗(yàn)材料細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并未受到嚴(yán)重的損傷，這與宋倩云[29]的研究一致。

Kanawapee等[30]對(duì)106個(gè)水稻品種的耐鹽性研究結(jié)果表明，在長(zhǎng)期的鹽脅迫條件下脯氨酸的積累量與水稻的耐鹽性及存活率之間呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，脯氨酸積累僅僅是植物受到脅迫時(shí)的應(yīng)答反應(yīng)，而與耐逆性無關(guān)[31]。本試驗(yàn)中存活率最高的材料L8在各個(gè)濃度的鹽脅迫下都能保持較穩(wěn)定的脯氨酸含量，而存活率較低的材料L2在中高度鹽脅迫下細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量急劇增加，說明細(xì)胞受到的脅迫加重，這與前人研究一致。并且試驗(yàn)中0.8% NaCl脅迫下多數(shù)材料的脯氨酸含量有大幅升高，這可能是由于0.8% NaCl脅迫引起了南荻細(xì)胞的滲透脅迫，南荻通過將液泡中儲(chǔ)存的脯氨酸運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中使細(xì)胞中脯氨酸急劇增加來抵抗高鹽環(huán)境[32]。個(gè)別材料如L6的脯氨酸含量在0.5%NaCl脅迫時(shí)出現(xiàn)偏差，這可能是由于該濃度下L6的根部加強(qiáng)了離子吸收能力以抵抗鹽脅迫，所以并未導(dǎo)致葉片中脯氨酸含量的急劇升高，這與段鈞譯等[22]的前期研究一致。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是植物鹽脅迫下主要的抗氧化物酶之一，在清除超氧離子、抵御膜脂的過氧化、減輕質(zhì)膜受損等方面起著重要作用[33]。在本試驗(yàn)中，NaCl濃度為0.8%時(shí)，材料P1和L3的SOD活性達(dá)到最高，說明高鹽脅迫下，這2個(gè)材料的抗氧化酶活性仍能保持較高水平，并且這2個(gè)材料的存活率也較高。這與李會(huì)云等[34]對(duì)高鹽脅迫下葡萄砧木耐鹽性的研究結(jié)果一致。植物細(xì)胞在鹽脅迫下所能忍受的活性氧水平存在一個(gè)閾值，在閾值內(nèi)，植物能夠通過提高抗氧化酶活性來清除活性氧自由基，當(dāng)超過這個(gè)閾值時(shí)，抗氧化酶活性便會(huì)受到抑制，活性氧過多積累，對(duì)植物組織造成傷害[35]。本試驗(yàn)中材料L5的SOD活性在0.2%和0.8%NaCl脅迫下發(fā)生了大幅降低，這可能是由于活性氧的積累超過閾值，抗氧化酶活性受到抑制。

3.3 鹽脅迫下試驗(yàn)材料的MlNAC2基因表達(dá)量與生理響應(yīng)的相關(guān)性

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明：MlNAC2與SbNAC1,ZmNAC1和SNAC1的親緣關(guān)系都較近[15]。過表達(dá)水稻脅迫響應(yīng)基因SNAC1可以明顯提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性和耐鹽性，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)脫落酸更敏感，氣孔閉合較多，失水較慢，但光合作用速率無顯著差異[36]。過表達(dá)玉米ZmSNAC1基因的耐旱、耐鹽性鑒定表明，轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下較野生型存活率提高了50%～52%，葉綠素含量提高了36%～47%，脯氨酸含量提高了17%～23%；轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下較野生型存活率提高了36%～40%；過表達(dá)ZmSNAC1顯著提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐旱和耐鹽性[37]。將高梁抗旱基因SbNAC1轉(zhuǎn)入玉米，在干旱處理下，轉(zhuǎn)基因株系存活率和葉片相對(duì)含水量較對(duì)照顯著提高，失水速率和氣孔導(dǎo)度顯著小于對(duì)照，并且轉(zhuǎn)基因株系葉片中ABA和H2O2含量顯著提高,氣孔關(guān)閉率明顯高于對(duì)照。正是這些生理指標(biāo)的改變提高了轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性[38]。在本試驗(yàn)測(cè)定的生理指標(biāo)中，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉綠素含量這些與光合作用相關(guān)聯(lián)的生理響應(yīng)與MlNAC2基因的表達(dá)較為相關(guān)。并且存活率高的材料L8和L9的MlNAC2基因表達(dá)量變化與光合因子多呈顯著或極顯著相關(guān)；而存活率低的材料如L4和L5的MlNAC2基因的表達(dá)量變化與各生理指標(biāo)多不相關(guān)。吉璐等[21]的前期研究表明：鹽脅迫12 h后，南荻葉片中MlNAC2基因上調(diào)了約350倍；MeJA激素誘導(dǎo)12 h后，MlNAC2基因上調(diào)了136倍，其它激素處理均有不同程度的上調(diào)；在根中的表達(dá)量變化相對(duì)葉片中不明顯；過表達(dá)MlNAC2基因的擬南芥抗旱性有所提高。大量研究證明，MeJA可通過影響氣孔行為、調(diào)控蒸騰和葉綠素含量來調(diào)節(jié)植物對(duì)脅迫的反應(yīng)[39]。由此推測(cè)，MlNAC2基因可能協(xié)同參與了植物激素的調(diào)控過程，間接通過調(diào)控植物的光合作用，氣孔運(yùn)動(dòng)、葉綠素發(fā)生等來提高植物在鹽和干旱脅迫下的生存能力。

4 結(jié)論

南荻不同基因型材料的MlNAC2基因?qū)}脅迫的響應(yīng)程度差異較大；葉綠素含量高的材料較葉綠素含量低的材料有更強(qiáng)的耐鹽性；凈光合速率和氣孔導(dǎo)度在中高度鹽脅迫下大都有積極的響應(yīng)；存活率較高，耐鹽性強(qiáng)的材料葉片中丙二醛含量、脯氨酸含量及超氧化物歧化酶的含量更趨于保持穩(wěn)定。所測(cè)生理指標(biāo)中與MlNAC2基因表達(dá)量最相關(guān)的為葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率一系列光合作用相關(guān)因子。本研究結(jié)果豐富了南荻多倍體群體耐鹽生理響應(yīng)及其與分子機(jī)理層面的相互聯(lián)系，為進(jìn)一步研究南荻多倍體的耐鹽性提供了借鑒。