系統性紅斑狼瘡ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化的臨床意義

曹程 王慶凱 楊寶剛 馬明靜

(河北省滄州中西醫結合醫院心內科，河北 滄州061001)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是好發于育齡期女性的自身免疫性彌漫性結締組織疾病，患者體內產生過量攻擊自身抗體，引起體內多器官、組織損傷，有效控制SLE病情可明顯延長患者生存時間[1-2]。SLE臨床癥狀具有多樣化特點，并且其臨床癥狀隨著SLE病情變化呈輕重交替出現現象，可出現全身性炎癥、皮膚黏膜、肌肉關節、腎臟和血液系統等疾病癥狀，還可引起胸腔積液、肺間質纖維化或肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)[3]。PH是由多種因素所致肺動脈壓異常升高疾病，也是SLE常見并發癥，系統性紅斑狼瘡合并肺動脈高壓(systemic lupus erythematosus and pulmonary hypertension，SLE-PH)具有疾病進展迅速，控制難度和致死率均高的特點[4-5]。因此，盡早采取積極有效的防控措施對改善SLE患者預后具有重要意義。DNA甲基化屬于DNA化學修飾形式之一，可在不改變DNA序列情況下改變遺傳表現。人類基因啟動子區域含有大量DNA甲基化修飾位點，某些基因啟動子區異常甲基化可誘導腫瘤、自身免疫性疾病和心腦血管疾病等發生[6-8]。現探討ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化與SLE相關PH預后關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2017年1月河北省滄州中西醫結合醫院收治的SLE患者123例，納入標準：(1)納入患者均符合中華醫學會風濕病學分會制定的《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》中的診斷標準；(2)年齡>20歲。排除標準：(1)合并先天性心臟病、原發性心肌病；(2)肺癌、肺栓塞、肺靜脈閉塞、慢性阻塞性肺部疾病和門靜脈高壓患者；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并嚴重肝腎功能障礙；(5)重疊綜合征；(6)認知功能障礙；(7)妊娠期、哺乳期婦女。納入患者對本研究均知情，自愿簽署知情同意書，通過本醫院倫理委員會批準。

1.2 分組方法

PH的診斷參照歐洲心臟病學會(ESC)制定的《肺動脈高壓診斷和治療指南》中的診斷標準[9][右心導管測量顯示肺動脈平均壓≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]將123例患者分為合并PH組(SLE-PH組，n=48)與不合并PH組(SLE-noPH組，n=75)。

1.3 檢測指標

1.3.1 基本資料

根據患者的臨床資料，統計分析患者性別、年齡、右心室內徑、右心房上下徑、右心房左右徑、左心室內徑、肺動脈寬度、射血分數、美國紐約心臟病協會(NYHA)分級、SLE疾病活動度指數(SLE disease activity index，SLEDAI)和伴隨疾病等情況。

1.3.2 ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化檢測

患者入院后，采集清晨空腹靜脈血4 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，采用全血基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)提取DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA以及DNA純化回收：向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)管中加入15 μL DNA Protect Buffer、85 μL Buffer mix和40 μL DNA樣本，混勻，于PCR儀(95 ℃ 5 min，60 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 85 min，95 ℃ 5 min，60 ℃ 175 min，20 ℃ 2 min)進行重亞硫酸氫鹽轉化；轉化完成后向樣本中加入310 μL Buffer BL、250 μL無水乙醇脈沖混勻15 s，12 000 r/min離心1 min，加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。加入500 μL Buffer BD，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心1 min，棄濾液。加入500 μL Buffer BW，12 000 r/min離心1 min(重復2次)。加入250 μL無水乙醇，12 000 r/min離心1 min，室溫揮發5 min，加入39 μL Buffer EB溶液洗脫離心柱中的DNA，將所得DNA用于甲基化特異性PCR檢測與瓊脂糖凝膠電泳判定甲基化結果。

根據人類基因數據庫核實ABCG1和GALNT2基因啟動子區以及上游序列，采用Primer Express Software v2.0(ABI公司)軟件設計ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化、非甲基化特異性PCR引物(引物由華大基因科技有限公司合成)，ABCG1甲基化：sense 5’-ATTTGTATTGTGATATCGACGAGAC-3’，antisense 5’-CTTACCTCCTCGATTCTAAACGTAC-3’，退火溫度54 ℃； ABCG1非甲基化：sense 5’-AGATTTGTATTGTGATATTGATGAGAT-3’，antisense 5’-AACTTACCTCTCAATTCTAACATAC-3’，退火溫度48 ℃； GALNT2甲基化：sense 5’-TTATAAGATAGATCTTTTTTTGTATC-3’，antisense 5’-CCGCTAATATGATTTTATTAT-3’，退火溫度48 ℃； GALNT2非甲基化：sense 5’-ATGTTATAAGATAGATTTTTTTTTTATT-3’，antisense 5’-AACCCACTAATATCAATTTTATTAT-3’，退火溫度46 ℃。甲基化特異性PCR體系：5 μL PCR Buffer，0.5 μL dNTP mix，0.5 μL sense引物，0.5 μL antisense引物，0.5 μL DNA模板，0.1 μL KAPA Taq DNA聚合酶，17.90 μL無菌水。PCR循環參數設置為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min，10個循環；95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，39個循環，72 ℃延伸6 min。收集甲基化特異性PCR產物用于瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統中的Quantity One軟件對目標條帶進行分析，觀察ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化情況。

1.3.3 不良預后

納入患者從入院治療日開始計算，跟蹤隨訪3年，記錄患者3年存活情況，以死亡作為患者不良預后判定標準。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 兩組患者基本資料比較

兩組患者年齡、性別、病程、射血分數和關節炎、口腔潰瘍、發熱、光敏感、肺間質病變構成比比較，均無統計學差異(P>0.05)；SLE-PH組雷諾現象、活動后胸悶、指端血管炎構成比和右心室內徑、右心房上下徑、右心房左右徑、肺動脈寬度、SLEDAI、ABCG1甲基化比率、GALNT2甲基化比率均顯著高于SLE-noPH組(P<0.05)，而左心室內徑和NYHA分級(Ⅰ～Ⅱ)構成比顯著低于SLE-noPH組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者基本資料比較

2.2 ABCG1和GALNT2基因啟動子區甲基化對SLE患者生存的影響

ABCG1啟動子區甲基化組平均生存時間為(30.53±1.08)個月，ABCG1啟動子區非甲基化組平均生存時間為(33.75±0.99)個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統計學意義(χ2=4.076，P=0.043)，見圖1。GALNT2基因啟動子區甲基化組平均生存時間為(29.91±1.44)個月，GALNT2基因啟動子區非甲基化組平均生存時間為(32.81±0.90)個月，Log-Rank檢驗顯示差異無統計學意義(χ2=2.661，P=0.103)，見圖2。

2.3 死亡組和存活組患者基本資料比較

在SLE患者中，死亡組雷諾現象、肺間質病變、ABCG1甲基化構成比率和右心室內徑、右心房上下徑、右心房左右徑、動脈寬度、SLEDAI均顯著高于存活組(P<0.05)，而NYHA分級(Ⅰ～Ⅱ)構成比率顯著低于存活組(P<0.05)，見表2。

表2 死亡組患者和存活組患者基本資料比較

在SLE-PH患者中，死亡組雷諾現象構成比率和SLEDAI均顯著高于存活組(P<0.05)，而NYHA分級(Ⅰ～Ⅱ)構成比率顯著低于存活組(P<0.05)，見表2。

2.4 Cox回歸分析SLE患者不良預后危險因素

將表2中差異有統計學意義的因素納入多因素Cox回歸分析，使用向前法進行Cox模型多因素分析SLE患者不良預后危險因素，結果顯示，NYHA分級(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良預后的危險因素(P<0.05)，NYHA分級(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預后危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析SLE患者不良預后危險因素

3 討論

SLE為多臟器受累的慢性自身免疫性系統疾病，中國SLE患病率為70/100 000，女性患病率為113/100 000[10-11]，SLE發病與遺傳、環境等多種因素有關。PH是SLE嚴重并發癥之一，其并發率為0.5%～43.0%[12-13]，肺動脈壓力增加和肺血管阻力升高是引起PH患者右心衰竭或死亡的原因之一[14-15]。SLE-PH與肺血管內皮功能障礙、血管重塑、自身抗體形成、免疫功能異常、肺血管炎和血栓形成等因素有關[16]。表觀遺傳學修飾可通過調控免疫相關基因表達水平參與心血管疾病、神經類疾病和惡性腫瘤等疾病的發生、進展過程。DNA甲基化是表觀遺傳學修飾方式之一，DNA甲基化可在DNA甲基轉移酶作用下將胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶，對基因表達有調節作用。

人類ABCG1位于21號染色體上，含23個外顯子，屬于跨膜半轉運體。ABCG1在腦、腎上腺、巨噬細胞、胸腺和肺部高表達，具有防止脂質過量積累和發揮預防動脈粥樣硬化的作用[17]。ABCG1可促進膽固醇從細胞流出，通過提高膽固醇在細胞膜雙層間運動，增強與成熟富脂載脂蛋白結合，清除體內多余膽固醇。GALNT2位于1號染色體上，含16個外顯子，屬于多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶家族成員，在O-糖基化反應過程中發揮重要作用。此外，GALNT2還可通過調節脂質代謝糖基化改變體內脂質水平，對調節體內脂質穩定性具有重要意義[18-19]。本研究結果顯示SLE-PH患者的SLEDAI、ABCG1甲基化比率和GALNT2甲基化比率顯著高于SLE-noPH患者，與研究[20]結果存在相似趨勢，出現此現象的原因可能與PH發病機制有關，脂質代謝紊亂可引發體內炎癥反應，內皮細胞炎癥趨化因子高表達可引起白細胞遷移，增強炎癥反應，引起血管內皮細胞功能損傷，增加PH發病風險。

本研究發現SLE-PH患者NYHA分級(Ⅰ～Ⅱ)構成比明顯低于SLE-noPH患者，已有研究[21]表明SLE-PH患者3年存活率為44.90%，而5年存活率為16.80%，SLE-PH降低患者存活率可能與PH所致心功能降低有關，SLE-PH可使肺血管炎癥內壁增厚，引起管腔變窄，肺循環阻力增大，導致肺部功能降低，從而影響患者預后。SLE早期伴隨的肺血管炎屬于急性病癥，及時給予免疫抑制劑、激素治療可逆轉，但隨著SLE疾病加重，肺血管炎則轉變為纖維素樣壞死，此病變屬于PH的慢性病理改變，臨床治療可逆性差，所以SLE-PH患者長期預后情況差。

本研究還發現ABCG1甲基化SLE患者3年平均生存時間明顯低于ABCG1非甲基化患者，而GALNT2甲基化與其非甲基化患者3年平均生存時間比較無統計學差異，說明ABCG1甲基化可能會影響SLE患者長期預后情況。此外，本研究發現雷諾現象、肺間質病變、ABCG1甲基化、NYHA分級以及心室內徑、心房大小可能對SLE患者不良預后存在影響，進一步Cox分析顯示NYHA分級(Ⅲ～Ⅳ)、SLEDAI(≥20分)和ABCG1甲基化是SLE患者不良預后的危險因素。NYHA分級(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預后的危險因素，可能是因為SLE-PH患者體內ABCG1甲基化水平較高，影響對膽固醇、脂質過量積累調節能力，引起血管內壁炎癥反應，血管內皮細胞功能降低，加重患者心功能損傷，導致患者預后生存時間減少。因此，SLE-PH患者可選用DNA甲基化轉移酶抑制劑治療以逆轉基因的甲基化狀態，恢復ABCG1和GALNT2表達，減少血管內皮細胞損傷，增強對膽固醇的調節作用，降低肺動脈壓力及不良預后的發生風險，從而延長患者生存時間。

本研究仍存在一定局限性，如納入患者主要為本地區患者，未納入經濟狀況和教育背景等其他人口學因素的影響；納入樣本數量較少，可能會影響研究結果的可靠性；隨訪時間只隨訪至3年，可能延長隨訪時間能得到更多的臨床代表性結果。

綜上所述，SLE-PH患者ABCG1和GALNT2甲基化構成比較高且ABCG1甲基化可能會影響SLE患者預后，NYHA分級(Ⅲ～Ⅳ)是SLE-PH患者不良預后的危險因素。臨床可增加DNA甲基化轉移酶抑制劑治療以逆轉ABCG1和GALNT2表達水平，注重患者心功能恢復救治，改善心臟的相應調節功能，以延長患者生存時間。