狹山野豌豆總黃酮富集工藝研究

桑育黎，劉景玉，郭方巖，辛躍強，石 磊，陳海剛，郝延軍

(1.遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036；2.華潤三九(郴州)制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.遼寧中醫藥大學 中醫藥科學院，遼寧 沈陽 110032)

0 引言

狹山野豌豆為豆科野豌豆屬植物，味甘、性平，具有活血、解毒、通絡、行水的功效，為蒙藥透骨草山野豌豆的變種，在民間亦作透骨草被廣為使用.臨床上多用在祛風除濕、活血止痛等病癥.通過前期實驗研究發現，中國藥典狹山野豌豆具有多種黃酮類化學成分.目前多采用黃酮類化合物作為指標性成分對野豌豆屬透骨草藥材進行質量控制[1].實驗以狹山野豌豆主要活性成分總黃酮含量為測定指標，對狹山野豌豆黃酮類化學成分的富集工藝進行了研究[2].

1 儀器與試劑

粉碎機RRHP-100型(香港歐凱萊芙有限公司)；電子天平(萬分之一)(北京賽多利斯科學儀器系統有限公司)；恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；無水乙醇(分析純)(天津市康科德科技有限公司)；大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；層析柱(沈陽瑞寶玻璃廠)；乙腈(色譜純)(德國Merk公司)；磷酸(色譜純)(天津市光復精細化工研究所)；超純水器(法國MILLIPORE).

2 實驗材料

狹山野豌豆2015年09月采集于遼寧省朝陽市朝陽縣小塔子，經遼寧省藥品檢驗檢測院王維寧教授鑒定為豆科(Leguminosae)野豌豆屬(ViciaL.)狹山野豌豆(V.amoenaFisch.Var.angustaFreyn.).樣品保存于遼寧省藥品檢驗檢測院中藥標本室.

3 實驗方法與結果

3.1 樣品溶液制備

精密稱取狹山野豌豆藥材粉末(4號篩)200 g，置5 000 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液4 000 mL(按1∶20體積比例)，加熱回流1 h，提取2次，提取溫度為90 ℃，提取液合并，蒸干，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL.

3.2 大孔樹脂預處理

將10種大孔樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使其充分膨脹.再依次用30%、50%、70%、95%乙醇水溶液沖洗，直至95%乙醇水溶液流出液與蒸餾水(體積比5∶1)混合[3]，液體不渾濁.再依次用95%、70%、50%、30%乙醇水溶液以及水沖洗各大孔樹脂，最終用蒸餾水沖洗至無醇味，備用.

3.3 大孔樹脂靜態吸附與解吸附篩選

3.3.1 色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，見表1；體積流量1.0 mL·min-1；紫外檢測波長為350 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL[4].

3.3.2 靜態吸附實驗

精密稱定10種經過預處理的大孔樹脂各1 g(干燥無水)，置于50 mL錐形瓶中，分別加入50 mL質量濃度為0.17 g·mL-1生藥溶液(5種黃酮苷濃度c0為0.640 4 mg·mL-1)，時時振搖(120 r/min)，振搖2 h，過濾，取續濾液.按“3.3.1”項下色譜條件，測定5種黃酮苷含量，計算，結果見表1.

3.3.3 靜態解吸附試驗

取上述過濾得到的10種大孔樹脂，分別置于50 mL錐形瓶中，分別加入50 mL 70%乙醇水溶液，時時振搖(120 r/min)，振搖2 h，過濾，取續濾液.按“3.3.1”項下色譜條件，測定5種黃酮苷含量，計算.結果見表1，數據表明HPD-826對狹山野豌豆總黃酮吸附與解吸附效果最好，適于狹山野豌豆總黃酮的富集.

表1 10種大孔樹脂靜態吸附與解吸附實驗結果

3.4 HPD-826型大孔樹脂動態吸附實驗

3.4.1 上樣濃度對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗

稱取5份經過預處理的HPD-826型大孔樹脂各10 g(干燥)濕法裝于各層析柱(Φ1.5 cm×20 cm)中，分別取0.2 g/mL生藥質量濃度的樣品50，100，200，400，800 mL，經過稀釋或濃縮定容至200 mL，超聲溶解，使樣品充分溶解，分別上柱，控制流速為2 mL·min-1，收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標進行檢測[5].實驗結果見圖1.

由圖1可以看出：當上樣質量濃度達到0.1 g/mL時，HPD-826型大孔樹脂對狹山野豌豆總黃酮的吸附率達到93.26%，其余濃度均低于90%.因此，將上樣濃度定為0.1 g/mL.

圖1 上樣濃度對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮的影響

3.4.2 pH對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響實驗

分別量取樣品溶液(總黃酮質量濃度為0.385 6 mg·mL-1)100 mL，共5份，其中4份用1 mol·L-1HCl溶液或1 mol·L-1NaOH溶液調節pH范圍1～2、3～4、5～6、7～8.將上述5份溶液依次加入HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，控制流速為2 mL·min-1，收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標進行檢測.實驗結果見圖2.

由圖2可以看出：上樣液體pH范圍應定為5～6.

圖2 pH對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗

3.4.3 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮泄漏曲線考察試驗

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質量濃度為0.377 89 mg·mL-1)，加入預處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調節流速為2 mL·min-1進行動態吸附，按樹脂床體積數收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標進行檢測.實驗結果見圖3.

由圖3可以看出：在工業化生產時若為單個樹脂柱時上樣體積為5倍樹脂床體積，若為多個樹脂柱串聯時，則最宜上樣體積為15倍樹脂床體積.

圖3 泄漏曲線考察試驗結果

3.4.4 洗脫劑對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗

分別量取pH 5～6樣品水溶液(總黃酮濃度為0.377 89 mg·mL-1)200 mL，分別加入4根預處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調節流速為2 mL·min-1進行動態吸附，收集流出液，濾過.先用水洗脫至近無色，再分別用30%、50%、70%和95%乙醇水溶液洗脫至近無色[6]，洗脫液過濾.將樣品流出液和洗脫液以5種黃酮苷含量為指標進行檢測.實驗結果見圖4.

根據圖4，最終選取70%乙醇水溶液作為洗脫劑的最佳濃度.

圖4 洗脫劑對HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗

3.4.5 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮洗脫曲線考察實驗

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質量濃度為0.359 25 mg·mL-1)200 mL，加入預處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調節流速為2 mL·min-1進行動態吸附，收集流出液，過濾.先用水洗脫至近無色，再70%乙醇水溶液洗脫，以3 mL·min-1流速進行洗脫，按樹脂床體積數收集洗脫液，過濾，將樣品流出液和洗脫液按“3.3.1”項下色譜條件，以5種黃酮苷含量為指標進行檢測.實驗結果見圖5.

由圖5可以看出：10倍樹脂柱床體積為最佳洗脫液體積.

3.4.6 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮純化工藝驗證實驗

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質量濃度為0.359 25 mg·mL-1)，加入預處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，上樣體積為5倍樹脂柱床體積，調節流速為2 mL·min-1進行動態吸附，收集流出液，過濾.先用水洗脫至近無色，再70%乙醇水溶液洗脫，以3 mL·min-1流速進行洗脫，洗脫體積為10倍樹脂床體積數，收集洗脫液，過濾，將樣品流出液和洗脫液按“3.3.1”項下色譜箱件，以5種黃酮苷含量為指標進行檢測.實驗結果見表2.

表2 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮工藝驗證實驗

4 結果與討論

1)前期實驗發現狹山野豌豆中可分離得到多個黃酮類化合物，狹山野豌豆的提取物對與免疫相關的TLR2、TLR4受體有激活作用[1]，且水提取物作用強度大于 95%醇提取物，推測狹山野豌豆的免疫調節作用可能來自黃酮類成分，因此優化狹山野豌豆總黃酮的富集工藝十分重要.

2)在前期實驗中，得到通過乙酸乙酯萃取的方法富集狹山野豌豆總黃酮，其結果為3.147 0 mg/g，而通過HPD-826型大孔樹脂對狹山野豌豆總黃酮富集，其結果為3.289 6 mg/g，因此，選取大孔樹脂更適合狹山野豌豆總黃酮的富集，且經過10種大孔樹脂對比，篩選出HPD-826為最佳型號.

3)本試驗對上樣質量濃度影響進行考察，依次為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 g/mL，在質量濃度為0.1 g/mL時吸附率最大.對pH進行考察，范圍依次1～2、3～4、5～6、7～8，在pH為5～6范圍時吸附率最大.對洗脫劑進行考察，雖然95%乙醇水溶液對總黃酮的解吸附率最高，但考慮節約資源選取70%乙醇水溶液.因此，當上樣質量濃度為0.1 g/mL，pH為5～6，洗脫劑為70%乙醇水溶液，洗脫體積為10倍樹脂床柱體積時，HPD-826對狹山野豌豆總黃酮的富集效果最佳.