蕓豆鹽堿響應NAC轉錄因子的分子特性分析

翟玲俠，于 崧，2，侯玉龍，秦 猛，朱雪天，王小琴，于立河，2

(1.黑龍江八一農墾大學 農學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省現代農業栽培技術與作物種質改良重點實驗室，黑龍江 大慶 163319)

NAC的命名源于矮牽牛基因NAM，擬南芥基因ATAF1、ATAF2及CUC2的首字母縮略詞，它是植物所特有的特異性轉錄因子[1-2]。NAC家族N末端高度保守，含有相似的DNA結合結構域，但其C末端高度多樣化，不包含任何已知的蛋白結構域[3-4]。利用植物基因組全測序，鑒定出多個作物中含有NAC轉錄因子，例如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有117個NAC基因，大豆(Glycinemax)中有152個，水稻(Oryzasativa)中有151個，煙草(Nicotianatabacum)中有152個，蕓豆(Phaseolusvulgaris)中有106個等[5-6]。同時，已有大量研究發現NAC轉錄因子在植物的生長發育過程中、抗逆反應過程中、應對各種脅迫過程中發揮著舉足輕重的作用[7-9]。如玉米ZmNAC33基因可以誘導包括DRE、MYC和MYB等基因的表達，從而改善植物的耐旱性[10]；大豆GmNAC15基因可以應對多種非生物脅迫，并且具有耐鹽性[11]；PwNAC2通過多種信號通路增強了植物對干旱的耐受性[12]；番茄SlNAC1通過提高過氧化物歧化酶、過氧化氫酶和保持較高的光化學效率等機制來提高植株對寒冷的耐受性[13]；GmNAC109參與了生長素信號通路，有助于調控毛狀根的形成[14]；BrNAC041參與ABA對GA在白菜葉片衰老過程中的拮抗作用[15]；在低溫、甘露醇和NaCl處理后，CaNAC035的基因沉默會抑制辣椒幼苗的生長[16]等。目前，越來越多的NAC轉錄因子被鑒定，但是對蕓豆NAC轉錄因子的功能研究較少，對鹽堿響應的分析更是鮮有報道。

植物的非生物脅迫包括干旱脅迫、低溫脅迫、鹽堿脅迫、高溫脅迫及重金屬脅迫等，在不同的理化因素逆境條件下植物會相應地產生抗性[17]。鹽堿是影響植物生長的主要環境因子之一，會對植物造成大量的影響[18]，如植株不能正常生長、黃化、萎蔫[19-20]、導致植株嚴重減產等[21-22]。蕓豆是豆科植物，可食用，學名為普通菜豆。蕓豆含有豐富的營養成分，如蛋白質、脂肪、碳水化合物、膳食纖維等，除供人們食用之外，在藥用方面也存在超高的價值，如提高免疫力[23]。近年來，蕓豆漸漸進入人們的視野，我國的種植面積也不斷擴大，然而蕓豆為鹽堿敏感作物，土壤鹽堿嚴重制約了蕓豆的生長發育[24]。

本研究利用高通量測序技術，建立100 mmol/LNaHCO3和100 mmol/LNaCl處理蕓豆葉片組織24，48 h的轉錄組，以水處理為對照，共獲得8個鹽堿響應NAC轉錄因子，利用染色體定位、進化發育關系、基因及蛋白結構、啟動子所含元件和組織表達模式等多方面進行綜合分析，為進一步研究蕓豆NAC轉錄因子的抗逆功能和調控機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 構建蕓豆葉片組織鹽堿脅迫轉錄組

本研究使用蕓豆品種為耐鹽堿品種HYD，用10% NaClO溶液浸泡10 min，用清水和無菌水各清洗3遍進行消毒，將消毒后的種子放置在發芽盒中，并在恒溫培養箱中25 ℃培養3 d催芽，選取發芽整齊一致的種子移栽到1/4霍格蘭營養液中，培養條件為光14 h/暗10 h (光強400 μmol/(m2·s))。培養5 d后換1/2霍格蘭營養液，當蕓豆長至第2對新生復葉時更換霍格蘭全營養液并加入100 mmol/L NaHCO3和100 mmol/L NaCl溶液處理，分別在處理24，48 h對蕓豆幼苗葉片的同一部位取樣，以0 h為對照，每個處理3次重復。取樣后放入液氮中冷凍并放置-80 ℃冰箱備用，后將所取樣品送至百邁客公司進行高通量測序。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

用所保存的0，24，48 h蕓豆葉片樣品，根據TRIzol法提取蕓豆葉片RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。之后使用東洋紡的反轉錄試劑盒，以總RNA為模板合成cDNA。

1.3 蕓豆NAC基因系統進化發育分析

利用Phytozome數據庫(https：//phytozome.jgi.doe.gov)下載蕓豆NAC基因的蛋白質序列，Blast與蕓豆NAC基因同源的擬南芥及水稻NAC蛋白。利用Mega 6.0軟件進行序列比對，并構建進化樹。

1.4 蕓豆NAC序列分析

在NCBI數據庫 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下載蕓豆NAC基因的CDS序列和蛋白序列，利用在線軟件MEME (http：//meme-suite.org)預測保守序列，通過GSDS (http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制基因結構圖，利用在線軟件SOSUI (http：//harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)進行蛋白跨膜結構預測，通過在線網站NetPhos 2.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預測磷酸化位點數目及種類，利用PSORT (http：//psort1.hgc.jp/form.html)進行蛋白亞細胞定位預測，利用在線生物信息學工具ExPASy (https：//web.expasy.org/protparam)對基因理化性質進行分析。

1.5 蕓豆NAC蛋白二級結構預測

利用在線網站PSIPRED (http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/#)預測NAC蛋白二級結構。

1.6 蕓豆NAC基因的染色體定位分析

在NCBI數據庫下載蕓豆染色體信息、基因信息及所在染色體位置，利用MapChart軟件制作染色體定位圖。

1.7 蕓豆NAC基因的啟動子分析

在Phytozome數據庫下載蕓豆NAC基因轉錄起始位點上游1 500 bp的啟動子序列，利用在線數據庫plantCARE (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)預測蕓豆NAC基因啟動子所包含逆境相關順式作用元件，使用IBS 1.0軟件繪制蕓豆NAC啟動子分析圖。

1.8 蕓豆NAC基因表達特性分析

將保存的蕓豆cDNA稀釋10倍做模板進行qRT-PCR分析，利用Primer 5軟件設計引物，以ACT11為內參[25](表1)，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量，利用Excel軟件分析并繪制柱形圖，每個樣品進行3次生物學重復。同時在Phytozome數據庫中獲取蕓豆在不同組織中的表達數據，利用TBtools軟件繪制熱圖。

表1 熒光定量PCR擴增引物序列Tab.1 Primer sequence amplified by fluorescence quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC基因的鑒定

蕓豆中含有106個NAC基因，根據轉錄組數據分析，共獲得8個鹽堿響應NAC轉錄因子，這8個基因能夠不同程度響應鹽堿脅迫，分子量為23 676.36～44 354.33 ku，蛋白編碼203～394個氨基酸，等電點4.74～8.86 (表2)，可見這8個基因理化性質差異不大。此外，有3個基因具有1～8個跨膜結構域。

表2 8個鹽堿脅迫響應NAC基因信息和理化性質分析Tab.2 NAC gene information and physicochemical properties analysis of 8 genes in response to saline-alkali stress

2.2 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC基因系統進化發育分析

為了進一步了解蕓豆耐鹽堿相關的NAC基因與其他植物來源的NAC基因系統進化關系，通過NCBI獲取了8個蕓豆及其同源擬南芥和同源水稻NAC序列，利用Mega 6.0軟件，構建系統進化發育樹。進化樹分析結果顯示(圖1)，8個蕓豆NAC被分為4個亞家族(a～d)，其中在a族中，蕓豆鹽堿脅迫NAC基因最多，c族中含有2個蕓豆NAC基因，而b族和d族中都僅含有1個蕓豆NAC基因，與其他基因親緣關系較遠。

星號標識代表該基因已有相關報道。The asterisk indicates that the gene has been reported.

2.3 鹽堿脅迫下蕓豆NAC基因結構和保守域分析

為了揭示蕓豆中NAC家族基因序列的多樣性，利用MEME在線預測工具，預測響應鹽堿脅迫的NAC蛋白中10個不同的保守元件 (圖2)，大部分都在N端，8個蕓豆NAC基因的N段均含有Motif 3，這些元件組成了蕓豆NAC轉錄因子特有的保守的DNA結合域。所有NAC基因的N端都含有4～6個不等的Motif，僅AT5G64530中不含有Motif 6，這表明該元件并不是在所有的基因中都發揮功能。所有亞族中都能看到一些特異性Motif，如Motif 7，8，10僅在d亞家族中所特有，且在b和d亞家族中不含有Motif 1。基因結構分析顯示，多數亞族的基因顯示了相似的外顯子-內含子結構，表明這些基因具有相似的特征。

圖2 8個蕓豆NAC轉錄因子保守基序及基因結構分析Fig.2 Conserved motif and gene structure analysis of eight common bean NAC transcription factors

2.4 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC基因染色體定位分析

對蕓豆8個鹽堿脅迫響應NAC基因在染色體上的分布統計發現，8個基因分別分布在8個不同的染色體上，除染色體3、7、10外，其他染色體上均有鹽堿響應基因分布(圖3)。

圖3 8個蕓豆NAC基因染色體定位分析Fig.3 Chromosomal localization of eight common bean NAC transcription factors

2.5 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC蛋白磷酸化位點和亞細胞定位點分析

8個NAC蛋白的磷酸化位點總數在15～33，不同蛋白間磷酸化位點數目相差較大，從3種磷酸化位點數目來看，絲氨酸數目最多，分別在10～22，其次為蘇氨酸，酪氨酸數目最少。通過Softberry分析發現8個蕓豆鹽堿響應NAC蛋白都定位在細胞核上(表3)。

2.6 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC蛋白二級結構預測

通過在線軟件PSIPRED預測8個蕓豆NAC蛋白二級結構，可以發現，所有NAC蛋白的無規則卷曲結構比例最高(表4)，α-螺旋的結構比例在7.9%～20.6%，而β-折疊的結構比例在7.6%～15.9%。

表4 蕓豆NAC蛋白二級結構預測Tab.4 Prediction of secondary structure of common bean NAC protein %

2.7 鹽堿脅迫響應蕓豆NAC基因的組織部位表達模式

利用蕓豆各NAC的編碼序列，在Phytozome數據庫中進行表達數據的檢索，共得到了8個蕓豆NAC基因的9個不同表達部位的表達譜。其中Phvul.005G084500基因在花蕾、花和未成熟的豆莢中均有較高的表達量，而Phvul.004G077400基因在幼葉中特異性表達，Phvul.009G156300基因成熟豆莢中有較高表達，Phvul.011G024700在各個部位均有所表達，其余4個蕓豆NAC基因在蕓豆部分組織中表達較低或不表達(圖4)。

圖4 8個鹽堿脅迫響應的NAC基因組織部位表達分析Fig.4 Tissue expression analysis of 8 saline-alkali response NAC

2.8 蕓豆鹽堿脅迫響應NAC基因啟動子分析

為了更深入地了解8個蕓豆NAC在鹽脅迫下的功能，利用PlantCARE數據庫分析蕓豆NAC的轉錄起始位點上游1 500 bp啟動子區域。結果表明，7個蕓豆NAC基因含有光響應元件(ABRE)，6個蕓豆NAC基因含有水分脅迫響應元件(MYB)和部分參與光響應的保守DNA模塊(Box 4)，5個蕓豆NAC基因含有光響應元件(G-box)、逆境響應元件(TC-rich)和厭氧反應元件(ARE)，4個蕓豆NAC基因含有ABA響應元件(MYC)和茉莉酸響應元件(CGTCA-motif)，2個蕓豆NAC基因含有光響應模塊(AE-box)，僅有一個蕓豆NAC基因含有WRKY響應元件(W box)。其中有一些元件在同一個基因中重復出現3次及以上，如ABRE元件在Phvul.008G159200啟動子中出現了3次，在Phvul.006G188900啟動子中出現了7次，在Phvul.005G084500啟動子中出現10次，Box 4元件在Phvul.008G159200啟動子中出現了5次，在Phvul.002G283600和Phvul.011G024700啟動子中出現了4次，ARE元件在Phvul.002G283600啟動子中出現過3次，G-box元件在Phvul.004G077400中出現3次，在Phvul.005G084500中出現5次，CGTCA-motif元件在Phvul.005G084500啟動子中出現3次，而MYC和MYB則出現4次，并且8個蕓豆NAC啟動子中都含有3～7種不同元件(圖5)。

圖5 8個鹽堿脅迫響應NAC基因啟動子序列分析Fig.5 Sequence analysis of 8 saline-alkali response NAC gene promoters

2.9 蕓豆NAC基因在不同時間點鹽堿處理下的表達分析

為了更深入地了解蕓豆NAC基因在不同時間點下鹽堿處理的表達，對從轉錄組中篩選出的8個鹽堿脅迫響應的NAC基因做了qRT-PCR分析，結果表明，在NaHCO3處理下4個NAC基因上調表達，2個NAC基因下調表達(圖6)；在NaCl處理下，1個NAC基因表現出了上調表達，4個NAC基因下調表達(圖7)。同時發現，有3個基因同時響應鹽脅迫與堿脅迫(圖8)，其中Phvul.001G192000和Phvul.008G159200在鹽堿脅迫下均下調表達，Phvul.009G156300無論在堿脅迫或是鹽脅迫都上調表達。

3個生物學重復，以0 h為對照，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖7同。Three biological replicates, with 0 h as the control, different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01).The same as Fig.7.

圖7 NaCl脅迫下蕓豆NAC基因的表達Fig.7 Expression profile of NAC gene in common bean under NaCl stress

圖8 8個蕓豆NAC鹽堿響應基因重疊韋恩圖Fig.8 Overlapped Venn plots of NAC salt-alkali response genes in eight common bean

3 討論與結論

NAC基因廣泛的參與植物生長發育和逆境脅迫響應，并且調控著植物生長發育的整個生命進程[26-27]，如調控細胞分裂[28]、調節植物的細胞生長[29]、誘導植株抗生素的合成[30]以及植物次生壁的形成等[31-32]。NAC轉錄因子被證明可以提高擬南芥的抗逆性之后，大量的NAC基因在作物中發揮的功能被陸續的報道出來，例如過表達脅迫誘導的SNAC1基因水稻在四葉期表現出更好的抗旱性和耐鹽性[33]；小麥中的TaNAC29基因參與鹽脅迫的響應，并能增強植株抗氧化酶的活性，減少鹽脅迫對植株的損傷[34]；SNAC2/OsNAC6轉基因水稻在低溫下細胞膜更穩定[35]。然而并不是所有NAC轉錄因子都可以提高作物的抗逆性，如甜瓜的CmNAC14，發現其過表達的轉基因擬南芥增加了對鹽脅迫的敏感性等[36]。現在，越來越多的NAC轉錄因子功能被鑒定出來，但在蕓豆中，NAC轉錄因子研究卻很有限，本研究通過蕓豆葉片組織的轉錄組數據，鑒定了蕓豆8個響應鹽堿NAC轉錄因子，表明這些基因在鹽堿反應中可能發揮重要的作用。

本研究通過進化發育分析、基因結構分析及保守域分析可以發現，8個蕓豆NAC基因被分為4個亞家族，包含已知的逆境相關NAC基因，其中AT3G15500基因被驗證和大豆的抗旱性相關[37]，Wu等[38]也提及Phvul.005G084500與干旱有關，而本研究中發現Phvul.005G084500與抗堿性相關，由此猜測a亞族中的基因可能與干旱脅迫及堿脅迫相關，可以發現有的基因不止在一種逆境下有所表達，一個基因可能同時響應多種非生物脅迫，本研究分析也得到3個基因同時響應鹽脅迫和堿脅迫。

轉錄因子通過與DNA上的特異性元件結合，會驅動下游基因的轉錄。像GmDGAT1A基因通過啟動子在轉錄水平調控油脂代謝相關基因的表達，從而影響大豆種子中油脂的合成與分解[39]，馮珊珊等[40]發現了與CBF冷反應通路相關的CRT/DRE元件，證明了TaEXPB12-A/B/D可能在CBF冷反應通路中承擔著一定的角色。本研究中一些逆境相關元件在啟動子中高頻出現，如ABRE、Box 4和MYB等，這表明NAC轉錄因子在參與蕓豆鹽堿脅迫信號調控網絡中，可能作為相關基因的上游調控因子，結合啟動子中相應結合位點從而激活或抑制基因的表達。

磷酸化位點是一種特殊的分子區域，它們對細胞中蛋白質的調節特別重要，它可以激活或停用蛋白質，在細胞信號轉導過程中起著重要的作用。有大部分的研究表明，轉錄因子可以通過蛋白磷酸化來提高植物的抗逆能力，像轉錄因子的MAPK可以改變細胞定位、蛋白質穩定性、反式激活或抑制活性、DNA結合活性和核小體結構的重塑。MAPK介導的WRKY8的磷酸化激活其DNA結合和轉移活性，并且WRKY8誘導下游防御基因[41]。本研究中8個NAC蛋白均有磷酸化位點，但磷酸化位點數目及類型有所不同，說明這8個蕓豆NAC蛋白的磷酸化位點都有可能被特定的蛋白激酶磷酸化從而影響植物的抗逆能力。通過對NAC蛋白的二級結構預測，可以發現無規則卷曲結構占據著主導地位，無規則卷曲有明確而穩定的結構，受側鏈相互作用的影響很大，它們經常構成酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位。

本研究對各組織表達分析發現，蕓豆的NAC基因在蕓豆植株各部位均有不同程度的表達。通過qRT-PCR驗證分析篩選出的8個蕓豆NAC基因在鹽堿脅迫下出現了不同程度的上調或下調表達，表明這8個基因在鹽堿脅迫中都具有一定的功能。

本研究從基因組范圍內對蕓豆NAC轉錄因子進行系統分析，從中鑒定得到了8個蕓豆NAC基因，表明這些基因可能在蕓豆鹽堿脅迫應答中發揮重要作用。利用生物學信息的方法對這些NAC基因的進化關系，啟動子分析和組織表達模式以及qRT-PCR等多方面進行了系統分析，發現蕓豆NAC出現不同程度的表達，表明其對鹽堿有一定的響應。本研究可以提供關于逆境誘導候選基因的有用信息，這些潛在基因發現對于提高作物抗逆性研究及蕓豆后續NAC轉錄因子的研究具有重要意義。