玉米矮稈突變體K718d的遺傳鑒定

董 麗，石海春，，趙長云，余學(xué)杰，，柯永培，

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 溫江 611130；2.四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，四川 雙流 610213)

在玉米生產(chǎn)中，高稈品種易倒伏，通常造成嚴(yán)重的減產(chǎn)；而矮稈玉米經(jīng)濟(jì)系數(shù)高，抗倒伏能力強(qiáng)，光能利用率高，利于密植高產(chǎn)。目前，已被定位的矮稈單基因有60多個(gè)(http：//www.maizegdb.org/)，包括隱性單基因br1、br2、d1、d2和d3等，顯性單基因D8、D9、D11和Dt等，其中br2[1]、d3[2]、D8[3]、D9[4]和Dt[5]等基因已被克隆；分布于10條染色體上，已定位的控制玉米株高的QTL位點(diǎn)300余個(gè)(http：//www.maizegdb.org/)，但目前玉米中能夠被應(yīng)用的矮稈資源有限，遺傳多樣性低，主要集中于br2[6]。因此，為發(fā)掘新的玉米矮稈種質(zhì)資源，并了解其遺傳特性，對推動玉米矮化育種具有重要意義。本研究中，以自然突變所獲得的矮稈突變體K718d為主要材料，研究其農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)和對外源激素敏感性；通過遺傳交配設(shè)計(jì)，分析該矮稈性狀的遺傳模式，并初步定位該矮稈基因，為之后基因的精細(xì)定位、克隆及育種中的利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

野生型K718；矮稈突變體K718d(P1)；5個(gè)高稈測驗(yàn)自交系(P2)：K1208、Q3、Ly118、Na2和K338；以及K718d與測驗(yàn)自交系組配的正反交F1、BC1、BC2、F2等群體。5個(gè)已知矮稈基因材料114F(br2)、110K(br1)、301(cr1)、K15d(br2突變體)、K123d(br2突變體)與K718d雜交配制的F1組合。所有材料均由四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司(簡稱公司)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 K718d與K718形態(tài)差異比較 于2019年在公司雙流區(qū)育種基地種植K718d與K718，選取其中30個(gè)有代表性的單株，對株高、穗位高等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察；各小區(qū)中收獲有代表性的10個(gè)果穗，考察主要經(jīng)濟(jì)性狀。用t測驗(yàn)檢測性狀差異顯著性，并對植株和果穗拍照對比。

1.2.2 K718d激素敏感性研究 選取K718d與K718種子浸種催芽，播于發(fā)芽盒，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，5個(gè)濃度處理，每處理25株，于兩葉一心期用0，25，50，75，100 μg/mL的GA3和IAA溶液隔1 d澆灌1次，20 d后測量苗高及第一葉鞘長度；內(nèi)源激素GA3測定參照徐敏等[7]方法測定。測定結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較分析(Excel 2010，Spss 20.0)。

1.2.3 K718d矮稈性狀遺傳模式分析 試驗(yàn)于四川崇州和雅安兩生態(tài)地進(jìn)行。各種植正反交F1群體84粒，BC1、BC2群體各168粒，F(xiàn)2群體各420粒。進(jìn)行分離群體的株高鑒定，χ2檢驗(yàn)株高分離比例，并確定遺傳模式。

1.2.4 K718d矮化基因定位 定位群體為K718d×Ly118 F2，于四川崇州育種基地播種2 184粒。單株編號掛牌，調(diào)查記錄高、矮植株。采用BSA-SSR法[8]進(jìn)行基因定位。從定位群體中選取極高、極矮株各20株，提取DNA后等量混合，用于構(gòu)建高、矮稈基因池。選取458對SSR引物于親本K718d和Ly118間和高、矮基因池間篩選出多態(tài)性引物后，在定位群體中的所有矮稈單株間進(jìn)行擴(kuò)增。DNA提取用2×CTAB法，PCR體系為25 μL，用3%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，采用MAPMAKER 3.0、MAPDraw V2.1[9]軟件進(jìn)行連鎖分析及遺傳圖譜的繪制。

1.2.5 K718d矮稈基因等位性鑒定 K718d與5個(gè)已知矮稈基因材料組配F1，并種植于公司海南陵水基地，各組合種植28粒，成熟期間觀察F1株高表現(xiàn)，確定基因等位關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 K718d與K718主要性狀比較

K718與K718d形態(tài)對比見圖1。K718d植株和穗位矮化，基部節(jié)間縮短，節(jié)間數(shù)減少，果穗變短。K718d與K718果穗均結(jié)實(shí)較好，筒型、籽粒半馬齒型，但K718籽粒略長，K718d籽粒略寬。

K718d與K718主要性狀差異列于表1。與K718相比，K718d生育期顯著延長，株高、穗位高、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長度分別減少48.23%，75.57%，30.83%和65.92%，差異均達(dá)極顯著水平；K718d穗粗增加8.31%，穗行數(shù)和百粒質(zhì)量差異不顯著，但穗長和行粒數(shù)分別極顯著降低28.57%，28.47%，導(dǎo)致單株產(chǎn)量極顯著降低36.44%。

表1 K718d與K718主要農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀比較Tab.1 Comparisons of the main agronomic and economic traits between the K718d and K718

A.植株 Bar=15 cm；B.莖稈 Bar=20 cm；C.節(jié)間 Bar=3 cm；D.果穗 Bar=3 cm；E.籽粒 Bar=1 cm。A.Plants bar=15 cm；B.Stem bar=20 cm；C.Internode bar=3 cm；D.Ear bar=3 cm；E.Kernel bar=1 cm.

2.2 突變體K718d對GA3和IAA的敏感性

經(jīng)2種外源激素處理后方差分析結(jié)果，除內(nèi)源GA3在材料間差異不顯著外，其余性狀在材料間和濃度間差異均達(dá)極顯著水平，材料與濃度互作間差異不顯著。K718d與K718比較，低濃度GA3處理下第一葉鞘長度差異不顯著，高濃度下差異極顯著，而各濃度處理苗高均達(dá)極顯著差異，但內(nèi)源赤霉素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))差異不顯著(表2)；不同IAA濃度處理，2個(gè)材料間第一葉鞘長度和苗高均達(dá)極顯著差異(表3)。2種激素處理，均不能使突變體苗高恢復(fù)至野生型水平，說明該突變體對GA3和IAA不敏感，但K718d能夠正常合成赤霉素，且轉(zhuǎn)運(yùn)GA3途徑正常。

表2 K718d和K718第一葉鞘長度、苗高、內(nèi)源赤霉素含量的多重比較 (GA3)Tab.2 Multiple comparisons of the first sheath length，seeding height，concentrations of endogenous GA3 between K718d and K718

表3 K718d和K718第一葉鞘長度和苗高的多重比較(IAA)Tab.3 Multiple comparisons of the first sheath length and seeding height between k718d and K718(IAA)

2.3 突變體K718d株高遺傳模式

2.3.1 正反交F1群體株高表現(xiàn) 將K718d配制的5個(gè)正反交群體平均株高列于表4。所有正反交F1在兩試驗(yàn)點(diǎn)均表現(xiàn)為高稈，經(jīng)t檢驗(yàn)正反交F1群體平均株高差異不顯著，初步說明株高無細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。

表4 正反交F1群體株高Tab.4 Plant height of reciprocal F1 populations

2.3.2 回交群體株高分離比例 以K718d為回交親本構(gòu)建的BC1回交群體，在兩生態(tài)點(diǎn)高稈與矮稈植株分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)均符合1∶1(表5)；而以5個(gè)測驗(yàn)種為回交親本的BC2回交群體在兩試驗(yàn)點(diǎn)均表現(xiàn)為高稈，表明K718d矮稈性狀可能由1對隱性核基因控制。

表5 BC1分離群體株高χ2檢驗(yàn)Tab.5 The χ2 test of plant height of BC1 segregation populations

2.3.3 F2群體株高分離比例 在2個(gè)生態(tài)點(diǎn)所有F2群體高稈與矮稈植株分離比例，經(jīng)卡方測驗(yàn)都符合3∶1，進(jìn)一步證明K718d的矮稈性狀由1對隱性核基因控制(表6)。

表6 F2分離群體株高χ2檢驗(yàn)Tab.6 The χ2 test of plant height of F2 segregation populations

綜上所述，K718d與5個(gè)測驗(yàn)系組配的正反交F1在崇州和雅安兩地均表現(xiàn)為高稈，其正反交組合株高差異不顯著，無細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)，受環(huán)境影響較??；K718d與F1構(gòu)建的BC1群體高矮稈植株分離比符合1∶1，5個(gè)測驗(yàn)系與F1構(gòu)建的BC2群體都表現(xiàn)為高稈，F(xiàn)2群體高矮稈植株分離比符合3∶1，表明K718d矮稈性狀受一對細(xì)胞核隱性基因控制，暫將其命名為d718。

2.4 矮稈基因d718定位

定位群體為K718d×Ly118 F2，選取458對均勻覆蓋于玉米10條染色體上的SSR引物，在雙親之間篩選出了170對多態(tài)性較好的引物后，繼續(xù)在高、矮稈基因池間篩選，篩出1對多態(tài)性引物umc1446；以該引物為參考，繼續(xù)合成1號染色體Bin1.06～1.09區(qū)段的45對引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選出了6對多態(tài)性引物，至此共篩選出7對多態(tài)性引物(表7)。圖2為7對多態(tài)性引物在F2群體高、矮稈基因池間的擴(kuò)增結(jié)果。

表7 7對SSR引物序列信息Tab.7 The sequence information of 7 pairs of SSR primers

D.高稈基因池；d.矮稈基因池。D.High stalk gene pools；d.Dwarf gene pools.

用上述7對引物在K718d×Ly118的F2群體的316個(gè)矮稈單株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測。用上述作圖軟件進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果連鎖分析后，繪制出遺傳連鎖圖譜。最終將該矮稈基因d718，初步定位于玉米1號染色體長臂上，位于SSR分子標(biāo)記umc1128與umc1278之間，遺傳距離分別為1.0，2.5 cM(圖3)。

圖3 矮稈基因d718遺傳連鎖圖譜Fig.3 Genetic linkage map of dwarf gene d718

2.5 d718基因的等位性鑒定

由于矮稈基因d718在染色體上與br1(1.07)、br2(1.06)等已知矮稈基因相近，有必要對該基因進(jìn)行等位性鑒定。K718d與5個(gè)矮稈測驗(yàn)系組配的F1群體株高統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，除K718d×110K株高表現(xiàn)為矮稈外，其他組合均表現(xiàn)為高稈(表8)。在5個(gè)矮稈測驗(yàn)系中，已知110K為br1材料，301為cr1材料，其余3個(gè)均為br2突變體，試驗(yàn)結(jié)果只有K718d與110K雜交F1群體植株為矮稈，由此表明d718為br1的等位基因。

表8 F1群體株高Tab.8 Plant height of F1 populations

3 討論與結(jié)論

3.1 矮稈突變體K718d表型特征

玉米莖稈節(jié)間數(shù)減少，節(jié)間長度變短可以造成株高的矮化，植物內(nèi)源激素通過促進(jìn)、抑制或改變生理活動，調(diào)控植物生長發(fā)育進(jìn)程，參與植物株高建成[10-12]。前人研究表明，突變體A2節(jié)間數(shù)減少，節(jié)間長度縮短，dm676節(jié)間極顯著縮短，從而導(dǎo)致植株矮化[13-14]，br1類矮稈突變體節(jié)間顯著縮短，平均單株產(chǎn)量只有野生型的2/3[15]，且br1對GA3不敏感，而突變體523333[16]、d0掖(478)、d0(齊319)和d0(PH4CV)[17]對GA3敏感。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型K718比較，K718d節(jié)間數(shù)減少近1/3，節(jié)間長度縮短近2/3，株高降低近1/2，平均單株產(chǎn)量降低36.44%，但穗粗增加8.31%，可用來改良玉米品種株高和穗型等性狀，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)不同濃度的GA3和IAA處理發(fā)現(xiàn)，該突變體為赤霉素與生長素鈍感型，與矮稈突變體br1和br2相似，但赤霉素合成及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑正常。推測造成突變體K718d矮化的原因，可能是植株生長過程中某一特定時(shí)期激素合成或運(yùn)輸有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 矮稈突變體K718d株高遺傳特性

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，玉米株高分為單基因遺傳和多基因遺傳2種模式，其中單基因遺傳又分為顯性和隱性2種[18-19]。王立靜等[20]和戚洪源等[21]利用矮稈突變體與普通玉米自交系構(gòu)建F1、BC和F2群體的方法，分析明確了矮生性狀的遺傳模式。王益軍等[22]發(fā)現(xiàn)了來自玉米自交系Mo17的一個(gè)顯性矮稈突變基因D*-10，并采用 SSR分子標(biāo)記技術(shù)，將該基因定位在玉米2號染色體上。王立靜等[20]把121C(D8)和502C(D9)的花粉授予玉米矮稈顯性突變體52333，取30株F1的花粉授予高稈自交系Lx9801，根據(jù)后代高矮稈植株分離比例，確定了Dt與D8和D9為非等位基因。

本研究用K718d與5個(gè)高稈自交系組配正反交F1、BC1、BC2和F2群體，分析矮稈性狀的遺傳模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K718d矮稈性狀由1對隱性核基因控制；并利用BSA-SSR分子標(biāo)記技術(shù)，將矮稈基因d718定位于1號染色體長臂上，位于分子標(biāo)記umc1128與umc1278之間，遺傳距離分別為1.0，2.5 cM；等位性鑒定發(fā)現(xiàn)，K718d與110K(br1)組配的F1群體株高表現(xiàn)為矮稈，表明d718與br1等位。后續(xù)將進(jìn)一步對d718進(jìn)行精細(xì)定位和克隆等研究，為育種應(yīng)用提供技術(shù)支撐。