大白菜抗干燒心病分子標記的開發與驗證

張 紅，徐瑩莉，王超楠，黃志銀，范偉強，李 梅，張 斌

(1.天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質創新國家重點實驗室，天津市蔬菜遺傳育種企業重點實驗室，天津 300381；2.天津市農業科學院 蔬菜研究所，天津 300384)

大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)是一種兩年生葉用蔬菜，隸屬十字花科蕓薹屬蕓薹種，其最早源于我國，并在我國栽培歷史久遠，屬于目前我國蔬菜栽培中分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物之一。據不完全統計，中國每年大白菜的播種面積約達266.7 萬hm2，占蔬菜總播種面積的15%左右[1]，產值超過600億元，是我國的主要出口創匯蔬菜之一。但近年來在大白菜栽培中由于土壤缺鈣或栽培管理不當等因素的影響下，一種白菜的生理性病害-干燒心病頻發且呈現日趨嚴重的趨勢，儼然已成為繼三大病害之后，又一嚴重阻礙大白菜生產的病害之一。該病發病后于外表難以察覺，但剖開后內部球葉呈現“夾葉爛”現象，對大白菜的產量及其結球品質均造成極大影響，嚴重的甚至導致品種完全喪失商品性，進而損害農戶的利益。

在實際栽培中對常見病害的防治措施主要分為3種，即物理防治、化學防治和抗病育種防治[2-6]。干燒心病是由缺鈣引起的生理性病害，屬于不可逆的生理紊亂，農耕等物理防治無法有效控制干燒心的發生，且改變復雜的栽培環境難度較大，使用化學藥劑防治成本高且易導致農業環境污染，相較而言，抗病育種無疑是最經濟、有效、環保的預防措施。但采用傳統的育種方法培育抗病品種，選育周期相對較長，耗費人力地力，且大白菜干燒心病受環境影響較大，因此，單純依靠主觀經驗和田間觀察來篩選育種材料會相對困難。隨著分子生物學的發展，將表型鑒定與分子鑒定相結合來探究干燒心病抗病遺傳規律，挖掘相關的抗病基因，開發連鎖緊密的分子標記，進而選育性狀優良的抗病品種顯然是開展干燒心抗病育種的最佳途徑。本試驗探究了青麻葉H227中抗干燒心基因的遺傳規律，并設計開發了緊密連鎖的抗干燒心病分子標記，同時結合F2及BC1F1的表型鑒定結果驗證了標記的適應性，既為抗病篩選提供了有效工具，也為今后開展干燒心病的高效抗病育種奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及分子標記

以白麻葉大白菜的高代自交系G83作為干燒心感病親本和輪回親本，青麻葉H227作為抗病親本，兩親本材料均經過3 a以上的田間表型嚴格篩選獲得，干燒心病抗感差異顯著。同步構建200株樣本量的F2群體和100株樣本量的BC1F1群體，材料均由天津科潤蔬菜研究所提供。

分子標記基于已發表的抗干燒心分子標記文章[7-13]和大白菜基因組數據庫。引物由華大基因公司合成。

1.2 大白菜干燒心病表型鑒定方法

大白菜的室內鑒定方法采用離體葉片扦插法[14-16]，即：將花泥均勻打孔，待大白菜生長至五葉期時，采集植株自生長點起的第2片真葉。用2% NaClO對離體葉片的葉柄消毒5 s，再用蒸餾水沖洗2遍。消毒后的葉片插入浸滿鑒定液(2 mmol/L EDTA-Na2，10 mg/L GA3(pH=6.0))的花泥中(圖1)。

圖1 大白菜干燒心病離體扦插鑒定Fig.1 Identification of Chinese cabbage dry burning heart disease in vitro cuttings

室溫下放置3 h后即轉入25 ℃人工氣候培養箱中，暗培養48 h后統計觀察每個葉片枯邊程度及1個視野中小黑點數。試驗重復3次，選取穩定表型進行統計。

白菜干燒心病病情調查方法和分級標準參考金秀卿等[7]所述，劃分為5個等級(表1)，按照0～7級標準評價單株發病情況(圖2)，再對病情分級加以整理，采用SPSS軟件對數據進行統計分析，計算遺傳參數并繪制頻數分布直方圖。

表1 大白菜干燒心病病情分級標準Tab.1 The grade standards of dry burning heart disease symptoms in Chinese cabbage

圖2 大白菜干燒心病離體葉片的病情分級標準Fig.2 The disease grading standard of isolated leaves of Chinese cabbage with dry burning heart disease

1.3 大白菜干燒心病的分子鑒定方法

采用改良后的堿裂解法[17]批量提取親本、F1、F2等待測大白菜基因組的DNA，利用分光光度計的OD260/280值對提取得到的大白菜基因組DNA質量進行評價。DNA呈現明顯單峰曲線，且OD260/280值介于1.8～2.0，表明DNA質量較好。合格的DNA樣品濃度即可統一稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存備用或采用10 μL的PCR反應體系進行擴增，擴增產物通過8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和快速顯影法即可統計檢測電泳條帶多態性。

基于上述表型鑒定及分子鑒定方法，利用Join Map 4.0軟件整理統計數據，將LOD設定為3.0，分析目標基因與分子標記間的連鎖關系，構建連鎖圖譜，完成基因的初步定位，并在定位區間內開發篩選與目標基因緊密連鎖的分子標記。

2 結果與分析

2.1 大白菜干燒心室內表型鑒定結果與遺傳學分析

利用離體葉片扦插法對干燒心抗感親本H227和G83以及F1、F2群體，BC1F1群體進行表型鑒定，根據表2的病情分級標準，觀察小黑點和枯邊性狀在各單株中的表現情況，通過室內表型的統計結果(表2)并利用病情級數繪制頻率分布直方圖(圖3)，發現H227和G83構建的F1趨向于抗病，F2群體和BC1F1群體病情分級呈現出明顯的單峰分布，接近于正態分布，因此，分析大白菜干燒心抗病遺傳規律為數量性狀遺傳，與金秀卿等[7]的結論相符合。

表2 大白菜干燒心病室內表型鑒定統計結果Tab.2 Statistical results of laboratory phenotypic identification of dry burning heart disease in Chinese cabbage

圖3 大白菜干燒心病病情級數在F2和BC1F1中的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of the dry burning heart diseaseprogression of Chinese cabbage in the F2 and BC1F1 generations

2.2 干燒心病抗性基因分子標記的開發

根據室內表型鑒定結果，從F2分離群體中選擇極抗(0級)和極感(7級)各12株構建抗感池。天津科潤蔬菜研究所大白菜課題組前期開展了大量干燒心病相關研究，金秀卿[18]針對干燒心抗感雙親H227和B120構建了DH群體，結合2 a的田間干燒心表型鑒定數據，利用MapQTL 5.0軟件進行了QTL分析，初步獲得了貢獻率大于10%的主效QTL位點，且位點位于A07染色體上，得到與抗干燒心病共分離的分子標記BrID10343和緊密連鎖的標記BrID10349，因此，試驗首先基于前期試驗基礎及已公布的抗干燒心分子標記在本試驗父母本及F1間進行多態性驗證，結果發現標記在本試驗雙親間缺乏多態性，分析可能標記與基因的連鎖性稍差，需繼續對大白菜基因組開展分子標記篩選(圖4)。

圖4 分子標記BrID10343對B120、H227、G83的電泳檢測Fig.4 Detection results of molecular marker BrID10343 on B120，H227，G83

首先確定抗病基因的染色體位置，根據大白菜基因組數據庫(http：//brassicadb.cn/)的信息，選擇平均分布于10條染色體上的30對分子標記在雙親H227和G83及F1間進行多態性分子標記的初步篩選，結果僅在A07染色體上獲得1對分子標記BrID101105具有多態性，多態性標記在24株極端抗感池驗證，仍表現穩定多態性。表明試驗材料H227的抗源基因的確位于A07染色體上，與金秀卿等[7]的染色體定位結果相符(圖5)。

圖5 多態性分子標記的篩選Fig.5 Screening of polymorphic molecular markers

根據A07染色體上的大白菜序列信息，參考標記BrID10343、BrID10349及多態性標記BrID101105的位置，瞄定在物理區間25～27 cM設計緊密連鎖的分子標記，利用Primer Primier 5.0軟件開發設計引物4對(表3)，將新設計的引物在雙親、F1和極端抗感池中進行篩選驗證，結果發現，分子標記BrIDCRT07具有穩定多態性。采用JoinMap 4.0和Mapchart軟件對BrID10343、BrID10349、BrIDCRT07等標記構建遺傳圖譜(圖6)，顯示該分子標記介于BrID10343 和BrID10349之間，與BrID10343的遺傳距離為0.13 cM，與BrID10349的遺傳距離為0.78 cM。

圖6 分子標記BrIDCRT07在A07染色體上的遺傳位置Fig.6 Genetic location of the molecular marker BrIDCRT07 on the A07 chromosome

表3 干燒心病引物序列信息Tab.3 Molecular marker sequence information of dry burning heart disease

2.3 干燒心病抗性基因分子標記的驗證

利用離體葉片扦插法和新設計的連鎖標記BrIDCRT07對F2群體及BC1F1群體分別進行分子鑒定和表型鑒定，結果如表4，5，F2群體內各單株的分子鑒定與表型鑒定統計結果基本一致，吻合率可達86.8%，BC1F1群體內分子鑒定與表型鑒定統計結果吻合率可達94.9%，表明該分子標記今后可用于抗病材料H227抗病基因的篩選。

3 結論與討論

天津青麻葉類型是我國大白菜家族中一個具有代表性的類型，屬于天津特有的類型，本課題組多年的田間調查也發現青麻葉大白菜不僅自身優良性狀眾多，對干燒心病也具有穩定的抗性，因此，適于作為抗原材料研究。

表4 F2干燒心病分子鑒定和表型鑒定Tab.4 Molecular identification and phenotypic identification of F2 dry burning heart disease

表4(續)

表4(續)

表5 BC1F1干燒心病分子鑒定和表型鑒定Tab.5 Comparison of in vitro cutting and molecular identification results of BC1F1 dry burning heart

表5(續)

本研究利用純合抗干燒心病的青麻葉骨干系材料H227作為母本，感病的白麻葉材料G83作為父本和輪回親本，分別構建F2及BC1F1群體，為了解遺傳特征，采用離體葉片溶液扦插法作為干燒心病表型鑒定方法，進行了重復試驗，經統計學分析發現，病情級數的頻數分布表現出明顯的單峰分布，接近于正態分布，遺傳規律表現為數量性狀遺傳特征，獲得的結果與前人[19-20]的研究結果一致。

而自1946 年Shafer 等首次報道大白菜干燒病的癥狀表現及病因以來，國內外學者針對此病開展了大量研究，也普遍認為干燒心病受到多基因控制[9-10]，抗病育種研究相對復雜。本研究相對金秀卿等[7]對干燒心基因采取的QTL定位方式不同，首次將植物中復雜的數量性狀通過分級轉化為簡單的質量性狀進行考慮分析，以F2和BC1F1作為定位和驗證群體，定向定位并開發了相對連鎖的分子標記，標記普遍適用于本試驗雙親所構建的回交后代，可以為大白菜干燒心抗病育種提供有力的篩選工具。

但考慮到不同類型不同品種間抗病基因或抗病性會存在一定的差異[6-8]。若試驗材料改變，可能會導致現有標記的通用性降低，例如在開發多態性標記過程中，本試驗基于前人[7]對同一抗病親本H227所開發標記BrID10343 和 BrID10349進行多態性驗證，發現標記在抗感親本H227和G83中不具有多態性?？赡苡捎谇叭说臉擞浥c抗性基因之間的連鎖尚不夠緊密，標記的通用性有限，因此，在應用分子標記輔助育種時首先進行通用性的驗證十分必要。下一步也將對標記的通用性持續進行驗證，并在本試驗基礎上不斷開發更緊密連鎖的分子標記。