CrxV 對水稻白葉枯病菌致病力的調控

林玉暖，候運郁，米 多，李春霞，陶 均

（1.海南大學 生命科學與藥學院;2.海南大學 熱帶作物學院,海口 570228）

環二鳥苷酸（c-di-GMP）是細菌中普遍存在的第二信使分子，首次在葡糖酸醋酸桿菌中被發現，是纖維素合酶的異構激活因子[1-2]。其后的研究結果表明，c-di-GMP 參與調節各種生物過程如致病性、運動性、生物被膜、胞外多糖及胞外酶等[3-4]。胞內c-di-GMP 水平受含有GGDEF、EAL 或HD-GYP 結構域蛋白的調控：GGDEF 蛋白負責c-di-GMP 合成，而EAL 或HD-GYP 蛋白參與c-di-GMP 的分解[5]。GGDEF 結構域含有約180 個氨基酸殘基，具有保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe 氨基酸殘基序列[6]。在新月形桿菌（Caulobacter crescentus）中，GGDEF 結構域蛋白PleD 具有雙鳥苷酸環化酶活性，調控細菌的運動功能，促進細胞從運動轉向靜止[7-9]。EAL 結構域長約250 個氨基酸，Glu-Ala-Leu 序列高度保守，可調控細菌生物被膜的形成和運動性[10]。有時GGDEF 和EAL 結構域共存于同一個蛋白中，可能只有其中1 個結構域有功能。例如，銅綠假單胞菌BifA 含有GGDEF 和EAL 結構域，但其沒有c-di-GMP 合成卻有分解活性[5]。稻黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）是引起水稻白葉枯病的病原菌[11]，可對水稻造成嚴重的產量損失。C-di-GMP 代謝相關蛋白同樣參與Xoo 致病力的調控，如：①GGDEF 結構域蛋白GdpX1 具有合成c-di-GMP 的活性，調節Xoo的運動能力、胞外多糖的含量以及致病力[12]；② EAL 結構域蛋白PXO_03877 具有降解c-di-GMP 的活性，增強細菌的致病性、運動性、胞外多糖合成以及生物被膜的形成能力[13]；③GGDEF/EAL 結構域蛋白PdeR 與組氨酸激酶PdeK 組成雙組份系統，磷酸化的PdeR 具有分解c-di-GMP 的能力，pdeR突變降低Xoo 的致病性、胞外多糖及生物被膜的含量，但對運動性和胞外酶無明顯影響[14]。本研究分析了Xoo 中另一個GGDEF/EAL 結構域蛋白CrxV 對運動性、生物被膜、胞外多糖以及胞外酶等毒力因子的調控作用，為進一步分析c-di-GMP 在Xoo 與水稻互作中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料Xoo野生型菌株PXO99A、大腸桿菌DH5a、基因敲除載體pK18mobSacB、過表達載體菌株pHM1 等均由筆者所在的實驗室保存；一般化學藥品購自廣州化學試劑公司；PCR 試劑購自諾唯贊生物科技有限公司；內切酶和連接酶購自NEB 生物科技有限公司；快速質粒小提試劑盒、瓊脂凝膠DNA 回收試劑盒等購自天根生物科技有限公司；IR24 水稻用于檢測Xoo的致病力；用SMART 軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守結構域。

1.2 突變體與互補菌株的構建及其致病力分析將crxV基因上下游各約500 bp 的序列通過PCR 擴增、酶切（HindIII/XbaI 與XbaI/EcoRI）回收后連接到自殺性載體pK18mobSacB（HindIII/EcoRI 酶切），獲得敲除載體pK-crxV，電擊轉化PXO99A菌株，采用同源重組2 次交換的方法構建突變體ΔcrxV[15-16]。利用PCR 方法擴增crxV基因片段，酶切（HindIII/EcoRI）回收后連接互補載體pHM1（HindIII/EcoRI 酶切），然后轉化ΔcrxV獲得互補菌株C-ΔcrxV（引物序列見表1）。為便于比較，野生型菌株和ΔcrxV也轉入空載體pHM1。采用剪葉法檢測致病力，將突變體菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株PXO99A-pHM1 和互補菌株C-ΔcrxV接種至生長期為60 d 的水稻葉片上，14 d 后統計水稻的發病情況。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 胞外酶活性檢測參照文獻[17]的方法檢測胞外酶的活性，將突變體菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株PXO99A-pHM1 和互補菌株C-ΔcrxV置28 ℃條件下液體培養48 h 后，取1 mL 培養物用ddH2O 洗滌2 遍，用1 mL ddH2O 重懸菌體。取3 μL 重懸液分別接種至纖維素檢測培養基、淀粉酶檢測培養基和蛋白酶檢測培養基上，在28 ℃條件下靜置培養5 d。PGA 培養基：1 g·mL-1Tryptone、1 g·mL-1葡萄糖、0.1 g·mL-1L-谷氨酸鈉、1.5% agar；纖維素檢測培養基為PGA 培養基+0.5%羧甲基纖維素；淀粉酶檢測培養基為PGA 培養基+0.1%可溶性淀粉；蛋白酶檢測培養基為PGA 培養基+2%脫脂奶粉。纖維素酶活性測定方法：0.1%剛果紅染色30 min，用1mol·L-1的NaCl 溶液洗2 次，觀察酶水解直徑(cm)；淀粉酶活性測定方法：1：100 I2/KI (0.08% mol·L-1I2，3.2 mol·L-1KI)溶液染色10 min，觀察酶水解直徑（cm）；蛋白酶活性測定方法：直接在蛋白培養基上觀察水解光圈（cm）。每個試驗重復3 次。

1.4 游動性檢測 參照文獻[18]的方法檢測游動性。用牙簽蘸取1.3 節中的菌重懸液，垂直接種于含0.25%瓊脂的游動性培養基（0.03%Tryptone,0.03%Yeast-extract,0.25%agar）底部，在28 ℃條件下靜置培養4 d，測量菌株在培養基表面游動的直徑（cm）并統計。重復3 次。

1.5 生物被膜及胞外多糖試驗參照文獻[19 -20]的方法檢測生物被膜的形成及胞外多糖的產生。取單克隆細菌在PSA 中培養48 h 后，取2 mL 菌在5 500 r·min-1條件下離心3 min，收集菌體，用M210 培養基（5 g·L-1蔗糖；8 g·L-1酶水解酪素；4 g·L-1Yeast-extract；3 g·L-1K2HPO4；0.3 g·L-1MgSO4· 7H2O，pH7.0）洗滌2 次，再加入M210 重懸，把重懸液的OD600調至0.5。生物被膜實驗：取2 mL 重懸液（OD600=0.5）接種至玻璃試管，在28 ℃下靜置培養4 d，緩慢倒出玻璃試管底的培養基，用H2O 洗滌3 遍，0.1%結晶紫染色液染色30 min，再用H2O 洗滌3 遍，加入3 mL90%乙醇溶解，在OD590下測吸光值。胞外多糖實驗：取2 μL 重懸液（OD600=0.5）接種至PGA 培養基表面，在28 ℃下靜置培養4 d，觀察菌落表面形態。試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 CrxV 保守結構域的預測結果根據SMART 預測結果，CrxV 含有GGDEF、EAL、HAMP 結構域(圖1)。GGDEF 和EAL 可能參與c-di-GMP 的合成與分解，而HAMP 可能通過調控CrxV 的二聚體化影響GGDEF 和EAL 的活性，因此，CrxV 可能參與c-di-GMP 的代謝，調控細菌對外界環境的響應能力。

圖1 CrxV 的保守結構域保守結構域預測采用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)；GGDEF：c-di-GMP 合成結構域；EAL：c-di-GMP 分解結構域；HAMP：CrxV 二聚化結構域。Fig.1 The conserved domains of CrxVCrxV conserved domains,analyzed by SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) with default parameters.GGDEF：The domain involved in c-di-GMP synthesis,EAL：The domain involved in c-di-GMP degradation,HAMP：The protein dimerization domain;Blue box:Transmembrane helix;Pink box:low complexity regions.

2.2 crxV 突變體的成功構建為了分析crxV的功能，本實驗采用同源重組2 次交換法構建了crxV的缺失突變體（圖2）。結果顯示：crxV突變體基因組擴增產物約為1 000 bp，而野生型PXO99A基因組擴增片段比突變體長約1 500 bp（與crxV基因大小一致），說明crxV突變體構建成功。

圖2 PCR 驗證 crxV 突變體（ΔcrxV）M：DL2000 Marker；1、2：ΔcrxV；W：野生型 PXO99A；N：陰性對照Fig.2 PCR confirmation of the crxV mutantM:DL2000 Marker;lanes 1 and 2:ΔcrxV；W:wild-type PXO99A；N:negative control.

2.3 crxV 突變與Xoo 致病性的關系為了分析基因對Xoo的致病性，本實驗構建了ΔcrxV的互補菌株C-ΔcrxV。致病性分析結果發現，ΔcrxV的病斑長度比野生型PXO99A的病斑長度減短了3 cm 左右，互補菌株的致病力與野生型基本一致（圖3）。說明CrxV 是Xoo 侵染所必需的。

圖3 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的致病性分析A：接種水稻14 d 后，野生型菌株PXO99A-pHM1、突變體菌株ΔcrxV-pHM1 和互補菌株C-ΔcrxV 的病斑特征，H2O 為空白對照。B：接種14 d 后的水稻病斑長度/cm (*:P<0.05,**:P<0.01)。Fig.3 Virulence analysis of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:The lesions caused by PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV (H2O:mock control).B:The lesion lengths (cm) of the infected IR24 leaves after 14 days’ inoculation of the indicated Xoo strains (*:P<0.05,**:P<0.01,compared withPXO99ApHM1).

2.4 crxV 突變與Xoo 運動性的關系運動性是Xoo的重要毒力因子之一，且受c-di-GMP 調控[21]，為此有必要分析crxV突變是否影響Xoo的運動能力。PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV的游動能力分析結果（圖4）表明，這3 個菌株之間泳動能力沒有顯著差異，說明CrxV不調控Xoo 的運動性。

圖4 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的 游 動能力上圖：細菌在平板上的游動表型；下圖：游動直徑的統計分析。Fig.4 The swimming abilities of PXO99A-pHM1,ΔcrxVpHM1 and C-ΔcrxVUp panel:swimming phenotypes of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV;Down panel:the diameters of swimming zones of the indicated strains.All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.

2.5 crxV 突變與Xoo 生物被膜形成的關系胞外多糖和生物被膜是Xoo的毒力因子，與細菌的致病性密切相關[14]。為分析胞外多糖的產生和生物被膜的形成，本實驗將菌株接種至PGA 固體培養基表面和M210 液體培養基中，靜置培養4 d 后發現，PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV菌落表面無明顯差別，而ΔcrxV-pHM1 的生物被膜形成的量比PXO99A-pHM1 高出了2 倍，回補菌株與野生型菌株的生物被膜形成量接近一樣（圖5），說明CrxV 負調控Xoo生物被膜的形成，但可能不調控細菌胞外多糖的產生。

圖5 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 產生生物被膜（A）及胞外多糖（B）的能力A：液體靜置培養4 d 后生物被膜含量分析。上圖：氣液表面生物被膜的結晶紫染色；下圖：生物膜含量的定量分析（*:P<0.05）。B：PGA 固體培養基上菌落的生長情況及表型特征。Fig.5 The biofilm (A) and extracellular polysaccharide (B)contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and CΔcrxVA:The biofilm contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV 4 days after incubation (*:p<0.05).Up panel:the crystal violet staining biofilm synthesized in the liquid-gas interfaces;Down panel:the biofilm contents of the indicated strains (OD590).All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.*:P <0.05,compared withPXO99A-pHM1.B:The colony phenotypes (4 days after incubation) of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV.

2.6 crxV 突變與Xoo 胞外酶活性的關系胞外酶通過Ⅱ型分泌系統將毒力因子分泌至胞外，促進細菌對寄主的致病力，胞外酶合成或分泌可能受c-di-GMP 調控[22-23]。如圖6 所示，PXO99A-pHM1、ΔcrxVpHM1 和C-ΔcrxV菌株間的胞外纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性均沒有顯著差別，說明CrxV 不調控Xoo 胞外酶的合成或分泌。

圖6 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 胞外酶活性分析A：蛋白酶活性；B：淀粉酶活性；C：纖維素酶活性。1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV。Fig.6 The extracellular enzyme activities of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:protease activities;B:amylase activities;C:cellulase activities.1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV.All the experiments were repeated triple times with same results.

3 討論

C-di-GMP 分別由GGDEF 結構域蛋白負責合成和EAL/HD-GYP 結構域蛋白負責降解，胞內受體通過感知c-di-GMP 水平調控細胞多個代謝途徑，影響細菌的生長及環境適應能力。通常低水平的c-di-GMP 提高細菌的運動能力，高水平的c-di-GMP 則有利于生物被膜的形成，調節細菌的致病能力[4]。在Xoo 中，GGEDF 結構域蛋白GdpX1，通過負調控胞外多糖的產生和運動性從而抑制Xoo 的致病性[12]。EAL 結構域蛋白PXO_03877 具有c-di-GMP 水解酶活性，正調控致病性、生物膜的形成和胞外多糖的產生[13]。PdeR 含有保守的GGDEF 和EAL 結構域，作為響應調節因子與組氨酸激酶PdeK 組成雙組份系統，正調控Xoo致病性和胞外多糖的產生[24]。同PdeR 類似，CrxV 也含有保守的GGDEF 和EAL 結構域，但其具體工作還不清楚。由于致病性與c-di-GMP 的含量可能成負相關[13,24],crxV突變導致Xoo 致病力降低，因此CrxV 可能作為c-di-GMP 分解酶，其GGDEF 結構域可能沒有酶活性。雖然研究發現Xoo 中影響致病性的c-di-GMP 代謝酶都可能調控諸如運動性、胞外多糖和胞外酶等毒力因子的合成或分泌[13,24]，但crxV突變并不影響這些因子的形成或分泌。有趣的是，crxV突變導致Xoo 生物被膜含量顯著增加。生物被膜形成和解聚是細菌致病重要的調節過程，缺一不可。因此，CrxV 可能負調控生物被膜的解聚，進而正調控病原菌的致病力。以上結果雖然顯示CrxV 可能通過介導c-di-GMP 代謝，影響病原菌生物被膜的含量，調控病原菌的致病力，但CrxV 的酶活性及其在生物被膜形成與解聚中的作用還不清楚，尚需做進一步研究。