p38MAPK信號通路介導miR-21在缺血再灌注腎損傷中的作用機制

劉戀紅， 李志輝

急性腎損傷是指各種原因所致的腎臟功能短期內急劇下降或喪失的一組臨床綜合征。目前全球每年約有15%患者，也就是約1 300萬急性腎損傷患者，其中約170萬人死亡[1-2]。缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷是急性腎損傷最常見病因之一，約50%的急性腎損傷住院患者是由IR損傷所致[3]。大量文獻報道，腎臟IR損傷中出現的腎小管上皮細胞凋亡、炎癥因子的產生均與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK)磷酸化密切相關[4]，抑制p38MAPK磷酸化可能是減輕腎臟IR損傷的重要靶點。據文獻報道，IR損傷中，各種刺激因子可調控p38MAPK及上游蛋白激酶可介導細胞及組織器官損傷。Ashraf等[5]指出，在IR損傷模型中，p38MAPK激活后使得線粒體中活性氧表達水平上調，證實了p38MAPK為活性氧上游激酶，而在使用p38MAPK的抑制劑Doramapimod(BIRB796)后，活性氧水平降低及細胞凋亡率減少。Xi等[6]研究表明，在系膜細胞培養中，轉化生長因子-β1 (transforming growth factor,TGF-β1)可誘導細胞的增殖與細胞基質的生長，增加環氧酶-2、前列腺素E2合酶-1和前列腺素E2的表達，并促進p38MAPK與細胞外調節蛋白激酶磷酸化，加劇TGF-β1介導的腎臟IR損害。Hong等[7]研究表明，二氧化鈦納米粒通過TGF-β/Smads/p38MAPK通路介導腎臟炎癥反應及纖維化。以上均可說明p38MAPK在炎癥反應、細胞凋亡、腎臟纖維化中的重要作用。

本課題組前期研究發現，microRNA-21(簡稱miR-21)參與了腎臟IR損傷的調控，絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated- protein kinase kinase3，MKK3)是miR-21-5p靶基因，miR-21在基因和蛋白質水平下調MKK3的表達[8]。而MKK3是p38MAPK的上游激活分子，能特異性磷酸化p38MAPK而調控p38MAPK信號通路。因而本研究建立了小鼠IR腎損傷及缺血預處理后IR腎損傷模型，旨在探討miR-21、p38MAPK、p-p38MAPK、IR損傷之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取C57BL/6J雄性小鼠200只(許可證號：SCXK(湘)2011-0003)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，6～8周齡，體質量20～22 g。按隨機數字表法分為空白對照組、IR組、假手術組及缺血預處理再灌注組(IPC+IR組)。除空白對照組以外，其他3組依據再灌注后的時間點(0 min、5 min、30 min、45 min、2 h、12 h、24 h、48 h)分成8個亞組，每亞組小鼠8只。

1.2 動物模型 小鼠適應性飼養1周后構建模型：(1)空白對照組：直接取出腎臟，不做任何處理。(2)IR組：采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后經腹正中切口開腹，暴露腎蒂，予無損傷動脈夾夾閉雙側腎蒂30 min后松開，建立IR腎損傷模型。(3)假手術組：游離雙側腎蒂但不夾閉，4 d后按IR組方法建立IR腎損傷模型。(4)IPC+IR組：按以上相同方法開腹，首先行雙側腎蒂夾閉15 min再灌注，4 d后按IR組方法建立IR腎損傷模型。

1.3 方法 將新鮮摘除的腎臟提取腎組織RNA，應用mRNA實時定量PCR試劑盒對合成的cDNA進行實時定量PCR反應測得腎組織miR-21表達水平；采取免疫組織化學法及蛋白印跡法測得腎臟組織中p38MAPK、p-p38MAPK表達水平；盲法取皮髓質交接部觀察腎臟病理得腎小管間質面積評分。正常記0分，腎小管間質受損的面積<10%記0.5分，10%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記3分，>75%記4分，采用此半定量分析法計算平均值，分值越高，損害越重。

2 結果

2.1 腎組織miR-21表達水平 空白對照組中miR-21表達水平在各亞組均呈較低水平表達。IR組miR-21表達水平在IR后5 min開始上升，于再灌注24～48 h達高峰，為基線值的15.2倍。IPC+IR組中，在預缺血處理后，miR-21表達增高，在之后IR各個時間點均保持在較高水平，約為基線值14.8倍(圖1)。假手術組miR-21表達水平基本與IR組表達一致。

圖1 各組小鼠腎組織miR-21的表達水平

2.2 各組小鼠腎組織p38MAPK及p-p38MAPK蛋白質的表達水平

2.2.1 蛋白印跡法檢測各組小鼠腎組織p38MAPK及p-p38MAPK的動態變化 各組小鼠腎組織在各組各時間點的p38MAPK蛋白質的相對表達水平(p38MAPK/β-actin)比較差異均無統計學意義(P>0.05)。在IR組、假手術組、IPC+IR組IR后p-p38MAPK相對表達水平(p-p38MAPK/p38MAPK)比較差異有統計學意義(P<0.01)。假手術組與IR組各亞組間的p-p38MAPK相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。IPC+IR組與假手術組、IR組各亞組間p-p38MAPK相對表達水平差異有統計學意義(P<0.01)，見表1和圖2。

表1 各組小鼠腎組織p-p38MAPK/p38MAPK相對表達水平比較

注：1～8代表再灌注后各時間點。1：0 min；2：5 min；3：30 min；4：45 min；5：2 h；6：12 h；7：24 h；8：48 h圖2 各組小鼠腎組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平的變化

2.2.2 小鼠IR后腎臟病理及腎小管間質損傷評分 空白對照組腎小管間質無明顯損害，IR組小鼠腎臟病理損害隨再灌注時間的推移逐漸加重，24 h達到高峰，此時有大范圍腎小管上皮細胞腫脹、變性，少量可見細胞碎片、紅細胞管型。部分腎小管上皮細胞刷狀源扁平、管腔擴張，部分腎小管上皮細胞片狀壞死、脫落，腎小管基底膜裸露。假手術組腎臟病理損傷與IR組基本相同；IPC+IR各亞組腎臟病理損傷的變化趨勢與IR組一致，但損傷程度較IR組明顯減輕，見圖3(封三)。腎小管間質損傷評分見表2。

表2 各組小鼠腎小管間質病理損傷評分比較分)

表2結果表明，IR組、假手術組、IPC+IR組各亞組腎小管間質評分比較差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

急性腎損傷是臨床上十分常見的危急重癥，在院期間發生急性腎損傷后明顯增加死亡率、增加住院時間、增多住院費用及影響愈后[9]。兒童的急性腎損傷發生率更是逐年上升，據McGalliard等[10]一項大型、前瞻性的單中心危重兒童隊列研究發現，嚴重的急性腎損傷的發生率為15.8%，死亡率6.1%。而IR損傷是急性腎損傷的重要原因，IR損傷包括缺血、腎毒素所致細胞直接損害以及系統性炎癥反應所致延續性損傷[11]。本研究即構建小鼠IR腎損傷模型，旨在探討IR損傷中炎癥通路的作用機制。

近年來關于miRs在IR損傷中的作用機制得以廣泛研究。miRs可以通過多種途徑參與IR損傷炎癥過程的調控，與中性粒細胞明膠相關脂質運載蛋白類似，存在于人體血、尿液中，故有望作為急性腎損傷早期診斷的生物學標記物[12-14]。有研究表明，miR-21在腎臟IR后顯著上調，證實其與IR損傷存在密切關系[15]。本研究組前期已通過生物信息學方法預測并證實了miR-21與MKK3存在靶向調節關系[8]。理論上MKK3是p38MAPK的上游，可通過對p38MAPK雙位點磷酸化而激活此信號通路。故p38MAPK信號通路與IR損傷之間同樣存在密切聯系。本研究結果顯示，在IR模型中，隨著IR時間推移，p38MAPK逐漸磷酸化，在2 h達到峰值；說明IR迅速啟動p38MAPK信號通路；而通過預缺血處理，p38MAPK磷酸化仍在2 h達到峰值，相較于IR組，p-p38MAPK/p38MAPK相對表達水平比值明顯降低，說明預缺血處理可保護腎臟，其保護機制即減少p-p38MAPK的表達水平，從而使得下游炎癥因子激活減少，減輕炎癥反應。

本研究中，IR組，miR-21隨著再灌注時間增加，表達逐漸升高，峰值與腎臟病理損害最重時間點重合。說明miR-21與腎臟IR損傷確實是密切相關的。通過對IR損傷模型先進行缺血預處理，在IPC的4 d之后再進行IR，發現miR-21表達水平維持在14.8倍基線值，p38MAPK蛋白表達水平趨勢與IR組并無明顯差別，在2 h達到峰值。也再次說明其靈敏度高的特點。但很顯然各個點的表達量有所下調，且在24 h表達水平降低相對幅度最大，24 h腎臟病理較IR組損害明顯減輕。表明在IPC后，miR-21可一定程度上調節p38MAPK信號通路。但p38MAPK之所以與miR-21表達趨勢不一致，主要考慮以下幾種可能原因：(1)p38MAPK屬于靈敏度很高的蛋白激酶，對于外來的各種刺激非常敏感，只要受外來刺激立刻可以被激活，所以峰值來得較早。(2)已知p38MAPK分有4個亞型：p38α、p38β、p38γ、p38δ，而分布在腎臟的主要為α、β、δ三型，而MKK3主要可對α、β、γ三型所激活。(3)并且p38MAPK上游激酶不僅只有MKK3，所以即便miR-21靶向調控MKK3，在24 h時間點MKK3的表達水平最低，而p38MAPK的磷酸化程度不一定最低。但從本課題兩部分中的p-p38MAPK表達水平的變化，以及課題組前期實驗成果，可以合理推斷：上調的miR-21可以靶向低調MKK3，并可以一定程度上抑制p38MAPK的磷酸化，減輕炎癥反應，從而減少小鼠模型的腎臟損害。

綜上所述，在小鼠IR損傷模型中，通過IPC后，高表達miR-21可能靶向低調了MKK3的表達，進而介導了p38MAPK信號通路，減輕炎癥反應，減輕小鼠腎臟的損害，起到一定保護作用。然而，因為miR-21分子具有多靶向性，生物學功能多樣化，p38MAPK具有非常高的靈敏度，是否能通過有效手段抑制兩者，作為減輕腎臟IR損傷的新干預的靶點應用于臨床仍有待于以后更進一步的研究證實。