新生兒窒息患兒早期腸道菌群特征研究

張華婷， 尹迪， 陳一歡， 龔小慧， 裘剛， 胡勇

新生兒窒息是指由于產前、產時或產后的各種病因使新生兒出生后不能建立正常呼吸，患兒處于缺氧狀態，從而引起全身多臟器損害，是圍產期新生兒死亡和致殘的主要原因之一[1]。圍產期窒息患兒早期胃腸道供血供氧受限，多有胃腸道功能紊亂，出現喂養不耐受、腹脹、腸鳴音減弱或消失等，甚至并發新生兒壞死性小腸結腸炎可能，一旦發生胃腸功能衰竭，病死率高，嚴重威脅新生兒健康。而新生兒腸道菌群早期定植對胃腸功能健康發育至關重要，但目前窒息患兒胃腸功能紊亂與腸道菌群相關性尚不明確，窒息患兒腸道菌群目前研究報道并不多。本研究旨在檢測窒息患兒糞便腸道菌群，探討窒息患兒腸道菌群早期定植與胃腸功能紊亂的相關性，分析新生兒窒息患兒腸道微生態特征及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1～6月在上海交通大學附屬兒童醫院住院治療的新生兒窒息患兒7例為研究對象，為窒息組，其中男5例，女2例；胎齡平均(279±11)d；體質量平均(3 147±381)g；順產4例，剖宮產3例。同期選取我院健康新生兒11例為正常對照組，其中男7例，女4例；胎齡平均(277±8)d；體質量平均(3 253±451)g；順產6例，剖宮產5例。兩組研究對象性別、胎齡、體質量、出生方式比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照《新生兒窒息診斷的專家共識》中新生兒窒息的診斷標準[2]。(1)Apgar評分1 min<7分，或5 min<7分，伴臍動脈血pH<7.2；(2)未取得臍動脈血氣分析結果的，Apgar評分<7分。

1.3 納入標準 (1)符合新生兒窒息的診斷標準；(2)足月出生，年齡0～3 d；(3)生后配方奶或配方奶為主喂養；(4)無抗生素及微生態制劑使用史；(5)本研究通過我院醫學倫理委員會審查，家屬均知情同意。

1.4 排除標準 (1)存在嚴重消化道畸形患兒；(2)存在遺傳代謝性疾病。

1.5 研究方法 采用無菌糞便收集盒收集入組患兒生后72 h內糞便標本，并立即保存到-20 ℃冰箱待進一步檢測及研究。為檢測糞便菌群分型，將采集的糞便樣本經過預實驗處理經過DNA提取、PCR擴增、純化、混樣、建庫及檢測后，通過IlluminaMiseq/Hiseq高通量測序平臺進行16S rRNA測序，將得到的數據Raw Reads經過質量過濾得到可靠的Clean Reads，并基于Overlap進行拼接得到Clean Tags，進而進行數據分析。

2 結果

2.1 腸道菌群多樣性分析比較 通過QIIME軟件分析所測菌群序列，對窒息組與正常對照組間菌群α多樣性指數分析，結果顯示窒息組Evenness多樣性指數顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。同時基于OTU豐度對兩組菌群β多樣性分析，主成分分析顯示出窒息組與正常對照組間菌群結構差異不顯著(P=0.142)，見圖2。

圖1 兩組間α多樣性指數分析

2.2 腸道菌群門、屬水平分類學組成分析 在兩組糞便樣本中菌群門水平主要以變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門以及放線菌門五個門含量相對豐富，進一步分析菌群屬水平成分，并檢測到相對豐度高的15個菌屬，通過LDA聚類分析，對照組新生兒糞便中檢測到厚壁菌門中兼性厭氧菌屬相對豐度較高，包括孿生球菌屬(Gemella)、顆粒鏈球菌(Granulicatella)、肉桿菌科屬(Carnobacteriacae)，此外變形菌門中菌包括嗜血菌屬(Haemophilus)、巴斯德菌科屬(Pasteurellaceae)的含量亦相對較高。而新生兒窒息患兒糞便中檢測以厭氧厚壁菌門菌屬為主，包括梭菌屬(Clostridiaceae)、韋榮球菌屬(Veillonella)、月形單胞菌屬(Selenomonas)、厭氧棍狀菌屬(Ananerotruncus)，以及變形菌門的包希氏菌屬(Bosea)等，見圖3(封三)。

3 討論

新生兒窒息是圍產兒常見的出生后疾病之一，窒息缺氧早期患兒通過潛水反射，機體血流重新分布，優先保證腦、心臟等重要臟器的血氧供應，而胃腸道、腎臟等非重要器官血流灌注明顯減少[3]，從而造成臟器損傷。隨著窒息加重，缺血缺氧、酸中毒也隨之加重，2016年我國一項新生兒窒息多中心研究發現，窒息特別是重度窒息患兒胃腸功能損害可達22.4%[4]，對新生兒早期胃腸功能完善，以及胃腸黏膜免疫的建立產生不可忽視的影響。

人體腸道內所有菌群及其代謝產物構成一個龐大而復雜的微生態系統，參與人體各項生理功能及代謝[5]。嬰幼兒時期是腸道菌群建立與發展的最為重要的時期，也易受環境因素、飲食結構、抗生素等影響。嬰幼兒時期腸道菌群的功能與各系統功能發育同步進行，包括參與胃腸功能、促進免疫功能發育、抑制炎癥反應等。目前研究在母親宮內無菌與否上尚有爭議[6]，但多項研究證實腸道菌群自出生即開始定植[1,7]。新生兒生后細菌很快從口、鼻、肛門上下兩端侵入，至第3天接近高峰。早期胃腸道內氧氣相對充足，兼性厭氧菌優先定植，包括大腸埃希菌、腸球菌。隨后逐步過渡為雙歧桿菌、擬桿菌、梭菌屬等占主導[8]，影響胃腸道的發育成熟，一方面參與機體復雜碳水化合物的代謝，也可以通過生物拮抗影響致病菌的定植與繁殖。

腸道菌群多樣性可以反應菌群的豐度和種類特征，菌群分布合理對維持腸道內環境穩態十分重要。研究表明使用抗生素可顯著降低腸道菌群多樣性[9]，新生兒期抗生素的使用可延緩腸道菌群的建立，使致病菌易于定植，引起抗生素相關性腹瀉等，而適當補充益生菌可能通過恢復腸道微生態平衡改善胃腸道癥狀[10]。研究表明健康新生兒出生時糞便菌群主要以兼性厭氧菌腸桿菌科定植為主[11]，本研究中對照組新生兒糞便優勢菌群為兼性厭氧厚壁菌門的菌屬，符合新生兒早期腸道菌群特征，這與既往研究結果一致。與窒息組患兒相比Evenness多樣性指數降低，窒息組患兒菌群中除兼性厭氧菌外，厭氧菌也明顯富集。這可能與健康患兒生后腸內氧氣相對豐富，致使厭氧菌難以定植有關。

本研究發現對照組新生兒腸道優勢菌以厚壁菌門為主，包括孿生球菌屬、顆粒鏈球菌、肉桿菌科屬，此外變形菌門中菌包括嗜血菌屬、巴斯德菌科屬，均為新生兒生后腸道菌群早期常見定植菌[11]，這些腸道菌群可以通過發酵碳水化合物后均可產生短鏈脂肪酸[12-13]，參與腸道黏膜屏障功能發育[14]。而新生兒窒息組患兒優勢菌則為梭菌屬、韋榮球菌屬、月形單胞菌屬、厭氧棍狀菌屬以及包希菌屬。證實了窒息患兒生后早期腸道菌群差異性改變，與窒息患兒早期胃腸道內缺血缺氧，可致使胃腸黏膜炎癥反應，對菌群定植產生影響，進一步影響胃腸黏膜屏障發育成熟。有研究表明，仔豬壞死性小腸結腸炎腸黏膜可檢測到大量梭菌屬[15]。此外本研究發現兩組患兒雙歧桿菌含量并不占優勢，既往研究表明雙歧桿菌定植與母乳喂養顯著相關，且多于生后第2天開始定植，于生后4～5 d后開始占主導地位[16]，故而早期檢測時并不占優勢。此外也可能與兩組患兒入組時喂養均以配方奶或配方奶為主喂養，致使雙歧桿菌定植延遲。

通過本實驗我們初步分析了新生兒窒息患兒腸道菌群特征，證實了新生兒窒息患兒早期腸道菌群定植與健康新生兒存在顯著差異。間接證實了窒息與新生兒早期腸道菌群定植存在相關性，可能影響新生兒早期腸道菌群多樣性以及優勢菌屬種類。這可能是窒息患兒胃腸功能紊亂的發病機制之一，進一步通過腸道菌群代謝產物對新生兒疾病的發生發展產生一定的影響。但本實驗樣本量偏小，且采樣點單一，不能系統比較新生兒窒息患兒腸道菌群的動態變化，未來可進一步加大樣本量，增加采樣點，以更好地揭示新生兒窒息患兒早期腸道微生態特點。