臍帶間充質干細胞經TLR4-NF-κB通路誘導產生regDC治療急性肝衰竭

王琳 吳慧麗 肖興國 張磊

急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)為免疫紊亂出現導致嚴重肝功能衰竭的臨床癥候群，但其發病機制尚未完全闡明，目前認為DC、T淋巴細胞等參與了AHF的發病[1]。Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLR)與炎癥反應的關系研究很多[2]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSC)已應用于治療AHF[3]，但治療機制尚不清楚。本實驗選取5例AHF患者外周血DC與hU-MSC共培養，體外觀察hU-MSC對患者單核細胞衍生的DC免疫調節作用，以期為AHF的臨床治療提供新的思路。

資料與方法

一、入組病例

篩選鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科2016年1月至2019年1月5例急性肝衰竭患者。急性肝衰竭診斷標準按照中華醫學會感染病學會肝衰竭與人工肝學組與中華醫學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組發布的《肝衰竭診治指南(2018版)》[4]。本研究經鄭州大學附屬鄭州中心醫院倫理委員會批準，所有研究參與者均簽署知情同意書。

二、方法

(一)hU-MSC的分離與培養 無菌條件下采集鄭州大學附屬鄭州中心醫院行剖宮產的足月胎兒臍帶，分離獲得臍帶wharton膠組織，剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃消化4 h后200目篩網過濾。收集濾液，1 700 r/min、離心8 min，重懸細胞沉淀接種于培養瓶中，在37℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中培養，第三代收集細胞進行表型鑒定、成脂成骨染色。

(二)人外周血單核細胞分離及DC體外誘導 取患者肝素抗凝外周靜脈血20 mL，Ficol法分離得到白膜層，PBS洗滌細胞2次，收獲PBMC。用含10 ng/mL GM-CSF、5 ng/mL IL-4和10%FCS的RPMI-1640培養基重懸細胞，37℃，體積分數為0.05的CO2培養箱培養；隔天半量補液，培養5 d備用。

(三)hU-MSC與DC共培養 hU-MSC融合80%時，加入絲裂霉素C(10 μg/mL)，37℃孵育4 h，PBS洗滌2次備用。收集培養第6天的DC，與處理后的hU-MSC按照10∶1混合培養于含有100 ng/mL TNF-α和10%FCS的RPMI-1640培養液中，48 h后收集細胞，進行流式表型鑒定。

(四)DC流式標記和檢測 取1×105細 胞于流式管，加入FITC-Lineage Cocktail 1、PE-anti-hunan HLA DR、APC-750-anti-human CD11c、APC-anti-human CD80或 APC-anti-human CD86，抗體用量按照說明書推薦量使用，標記總體積為100 μL。設置同型對照管，加入相同濃度的同型對照抗體。

(五)多因子檢測 采集24 h hU-MSC與DC共培養細胞上清液，使用LEGENDplex自定義11細胞因子檢測板，根據說明書分析以下11個因子：IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10、TNF-β、IFN-γ、IL-17A、IL-12p40、IL-4和TNF-α。實驗重復進行，以確保加載標準。最后用Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter，Krefeld，美國)進行分析，數據通過Legendplex V8.0軟件(Biolegend)進行分析。

(六)蛋白質印跡檢測 收取DC，加入細胞裂解液 Buffer(62.5 mmol/L Tris-HCl，2% SDS，10% 甘油，50 mmol/L DTT，1 mmol/L Na3VO4，cocktail proteinase inhibitor，0.01%w/v 溴酚藍)勻漿，經超聲破碎后，SDS-PAGE電泳，轉膜，分別與 NF-κB-p65、IKKα及TLR4抗體4℃孵育過夜，HRP標記的相應二抗37℃孵育90 min，ECL 顯影，凝膠成像系統觀察拍照。

(七)全轉錄組測序及差異分析 提取5例患者共培養前后DC總RNA，選取其中RNA完整且同時量足夠的3例患者RNA，去除 rRNA，探針法純化rRNA并進行片段化。應用非接觸式全自動超聲波破碎儀，將RNA打斷成100～300 bp，反轉錄合成cDNA并構建文庫。利用 T4 DNA 連接酶將 illumina 測序接頭連接至文庫 DNA 兩端，進行文庫片段篩選。采用 Illumina 高通量測序平臺，2×150 bp 雙端測序策略對文庫進行測序。采用Deseq2軟件分析兩兩分組的case 組與 control組的差異表達基因。

三、統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件。2組間數據采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、hHU-MSC的生物學特性及鑒定

觀察第3代hU-MSC呈成纖維樣，細胞大小與形態均一、排列有序定向分化(圖1A)。實驗結果顯示hU-MSC可成功誘導分化為脂肪細胞(圖1B)和骨細胞(圖1C)。流式細胞儀檢測hU-MSC表面標記顯示，CD90、CD105、CD73為陽性表達，陽性率分別為94.38%、99.86%、99.86%，而CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR為陰性表達,符合國際上對hU-MSC的界定。

A：第3代hU-MSC；B：脂肪細胞；C：骨細胞

二、DC細胞形態

1. imDC：培養第3天時，細胞周邊出現較短的樹突狀突起，且細胞呈現聚集生長，并且此現象隨時間增加愈發明顯，此時形成的細胞即為 imDC；2. maDC 形態(圖2A)：向 imDC 中(培養第 4～5 天)加入 TNF-α后成簇的imDC逐漸分開，細胞體積變大，細胞外突起增多、變長，此時即形成 maDC；3. regDC形態(圖2B)：共培養后發現imDC粘附生長，形態與maDC相比有一定差別，新細胞樹突較少，在TNF-α的作用下，形態沒有大的改變。

三、DC細胞表型鑒定

imDC高表達CD11b，低表達CD11c，共刺激分子CD80、CD86的表達也相對比較低，I-A的表達量也不高；maDC高表達I-A，共刺激分子CD80和CD86的表達量較 imDC高，但是其低表達CD11b；regDC高表達CD11b，低表達共刺激分子CD80、CD86，二類分子I-A的表達量較低。regDC的表型具有CD11b high CDIa low CD11c low的特點，與maDC相比，共刺激分子CD80、CD86呈低水平表達，與imDC比較相像。 與對照組相比，共培養組DC的表型具有 CD11b high Ia low CD11c low的特點，與maDC相比，共刺激分子 CD80、CD86 呈低水平表達，與 imDC比較相像(圖3)。

圖3 流式細胞術分析DC及hU-MSC+DC組表型

A：maDC；B：regDC

圖2 hU-MSC共培養誘導FHF患者外周血DC形態(×100)

四、LEGENGplexTM多因子流式檢測

MSC與DC細胞共培養后，檢測了DC細胞因子的分泌情況MSC-DC組IL-10、IL-12p40表達水平較對照組明顯增多，IL-1α 、IL-1β和IL-6 表達水平較對照組明顯減少(表1)。

表1 DC與hUC-MSC共培養前后細胞因子表達的比較(pg/mL，±s)

五、蛋白質印跡檢測TLR4、IKKα與NF-κB-p65蛋白表達變化

hU-MSC共培養組NF-κB-P65與TLR4表達水平明顯低于對照組，而IKKα蛋白表達高于對照組；NS398處理組NF-κB-P65與TLR4表達水平明顯低于共培養組及對照組，IKKα蛋白表達明顯高于其他兩組，差異均有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 TLR4、IKKα與NF-κB-p65蛋白表達水平(±s)

六、全轉錄組測序分析MSC處理后的DC基因表達譜的改變

MSC與DC共培養后對FHF患者外周DC有一定的影響，選取5例患者MSC-DC，以每例患者非MSC共培養組DC為對照組，進行全轉錄組測序，比較兩組全部表達差異的基因。MSC-DC和DC組共有2 790個表達差異的基因(≥2倍，或≤0.5 倍)。與DC組相比，MSC-DC組分別有2 127個上調表達的基因，663個下調表達的基因(圖4)。

注：紅色表示樣本相對于對照樣本表達量上調的基因，綠色表示下調基因，藍色表示無顯著差異的基因

圖4 差異基因表達火山圖

討 論

MSC已被證明可以干擾DC的分化，MSC具有抑制單核細胞分化為未成熟DC的能力，并且這種抑制作用是可逆的[5]。有研究表明，與MSC共培養的DC，即使暴露于成熟因子，仍不表達CD83，并且未能表現出成熟標志物，如MHCⅡ類分子，CD40或CD86的上調[6]，與本研究結果一致。表明MSC抑制DC的分化，導致未成熟DC的形成，并表現出抑制功能或抑制性表型。

DC在AHF的發病機制中分為兩個階段：①DC的前體細胞即單核細胞迅速進入血液循環；②DC遷移至受損的肝臟組織并被活化，并分化為成熟的DC，同時活化淋巴結中的T細胞使其向受損的肝臟遷移。LPS誘導的肝臟DC細胞活化，并分泌大量TNF、IL-4、IL-5等，在AHF發病中起關鍵作用[7]。而調節regDC也是免疫反應的關鍵細胞。本研究發現MSC誘導的regDC表現出髓系分子CD11c、提呈分子Ia和共刺激分子CD80、CD86表達下調，而CD11b的表達上調，這表明MSC誘導出了一種不同的DC群體。本研究顯示，MSC-DC組分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6降低，但IL-10增加，這是regDC群體的一個特點。由于體外誘導DC分化成熟需要IL-4和TNF-α，因此目前無法分析這兩種因子的促炎作用，但是提示MSC可以通過調節DC的分化進而分泌抗炎細胞因子、抑制促炎細胞因子行使免疫調節作用。

TLR作為一種重要的PRR，主要表達于DC細胞表面，構成機體抵御病原體入侵的第一道屏障[8]。LPS與TLR4結合后，通過受體本身胞內段的結構域募集接頭分子MyD88，活化IKKα、IKKβ、IKKγ，最終激活NF-κB轉錄因子，相關促炎性細胞因子TNF-α、IL-6 、 IL-1β和趨化因子，對病毒進行原始攻擊,發揮天然免疫的作用，同時促進DC的成熟，從而啟動獲得性免疫[9]。有研究表明，COX-2 抑制劑發揮抗炎和抗增殖作用主要通過抑制轉錄因子NF-κB或AP-1的負反饋調節來減弱NF-κB的表達[10]。本研究結果表明，共培養后，NF-κB-p65與TLR4蛋白水平表達明顯下降，而IKKα由于組蛋白修飾減少而表達量上調，以NS398阻斷NF-κB 下游基因COX-2表達的條件下觀察hU-MSC對DC的調節作用，結果發現由于負反饋調節機制, NF-κB-p65與TLR4蛋白表達繼續呈現下調趨勢，而IKKα蛋白表達再次顯著上調。提示hU-MSC可能通過調節AHF患者DC的分化成熟進而影響與TLR4的結合，從而導致IKKα激活的減少，使得NF-κB-p65絲氨酸635磷酸化受阻，最終阻斷NF-κB通路影響炎性因子的產生。

本研究通過全轉錄組測序篩選出上調表達TOP20的基因中有八個與炎性因子負調控明顯相關。這些差異表達基因有助于優化治療方案，選取可用于診治的基因做進一步研究。

綜上所述，hUC-MSC通過TLR4/NF-κB/COX-2信號通路抑制DC的分化及成熟，產生regDC進行免疫調節，同時抑制炎性因子和炎性介質過表達，促進抗炎因子表達，有效降低全身炎癥反應發生率，最終緩解急性肝衰竭的進展。