基于全基因組重測序策略對谷氨酸棒桿菌外源蛋白高產菌株相關基因的挖掘及初步驗證

孟麗虹，劉秀霞*，楊艷坤，白仲虎

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是食品安全級菌株，被廣泛用于生產許多有價值的氨基酸和副產物[1]。由于其具有完整的分泌途徑，無內毒素且可高密度發酵等特性，近年來已發展成為能夠生成多種外源蛋白的卓越表達系統。然而，由于原始菌株的自然局限性，仍然存在一些缺點，如產量低，可用遺傳操作工具匱乏等[2]。隨著基因工程技術以及合成生物學技術的廣泛應用，人們有了更多改造宿主的方法，從而提高目標產物的產量，此系統已成為實驗室研究及商業生產重組蛋白的熱點[3-4]。

目前，隨著基因組學和蛋白質組學的深入研究，為挖掘相關目標信息提供了分析手段。目前大多數外源蛋白都依賴微生物表達系統進行生產[5]。然而，由于底盤細胞代謝機制的復雜性，使理性改造存在一定的困難。因此從表型差異入手，結合全基因組重測序，可以進一步分析差異表型相關的候選基因[6]，為高效宿主的開發提供方向。目前，分析基因組區域和區域內變化的基因已成為一種挖掘表型差異相關候選基因的有效方法[7]。例如，ZHANG等[8]在全基因組水平篩選并鑒定了15種梨火疫菌的Sec依賴分泌蛋白酶。外源蛋白表達是一個復雜的耗能過程，涉及轉錄、翻譯、運輸、分泌等多個過程，受多基因調控，路徑復雜。因此基于表型差異，采用組學的方法挖掘不同菌株之間的差異基因，有望為底盤細胞的優化改造找到潛在的靶點，最終達到提升宿主蛋白表達能力的目的。

該研究基于全基因組重測序策略，對谷氨酸棒桿菌外源蛋白高產突變菌株進行單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)挖掘，并結合生物信息學分析SNP基因的結構極其功能。進一步通過構建SNP基因過表達和敲除菌株，評估這些基因表達變化對菌株生長以及外源蛋白增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)和人重組特立帕肽(recombinant human teriparatide, rtPTH)表達的影響。最后利用SWISS-MODEL軟件對基因GL002370編碼的蛋白進行建模，并分析了蛋白的功能。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養條件

在該研究所用的菌株見表1。大腸桿菌JM109，谷氨酸棒桿菌原始菌株和谷氨酸棒桿菌高產蛋白突變菌株(經常溫室壓等離子體誘變所得)均由本實驗室保存。大腸桿菌JM109用于質粒構建，谷氨酸棒桿菌是宿主改造和表達重組蛋白的底盤細胞。在LB培養基中于37 ℃、200 r/min條件下培養大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌菌株在LBB培養基(色氨酸10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，腦心浸出液10 g/L)中于30 ℃、220 r/min培養。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌培養物中使用的卡那霉素和氯霉素質量濃度分別為30、15 μg/mL。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 全基因組重測序分析

將誘變篩選得到的菌株進行全基因組重測序。分別準備50 mL 菌液離心樣品(OD600= 10)送至華大基因公司測序。其在北京基因組研究所分別使用PacBio RS Ⅱ平臺和Illumina HiSeq 4000平臺對突變菌株進行了重測序，以檢測潛在的SNP位點。

1.3 蛋白結構分析

利用NCBI數據庫，進行Protein BLAST分析，查找相似性最高的同源序列，獲得FASTA文件。利用CD-search查找蛋白保守結構域。

1.4 質粒

在該研究所用的質粒見表2。組成型質粒con-pEC-XK99E，用作谷氨酸棒桿菌中基因過表達載體；質粒pK18 mobsacB為谷氨酸棒桿菌基因敲除載體；質粒pXMJ19為谷氨酸棒桿菌中外源蛋白表達載體。上述3個質粒均由實驗室保存。

表2 本研究所用質粒Table 2 Plasmids used in this study

1.4.1 過表達質粒構建

根據全基因組重測序數據，分析突變位點。根據谷氨酸棒桿菌基因組序列設計擴增突變基因片段的引物。分別擴增基因片段，同時用EcoR Ⅰ和PstⅠ對質粒con-pEC-XK99E進行酶切。用ABclonal同源同組連接基因片段和酶切載體，連接產物轉化大腸桿菌感受態。培養出的轉化子采用PCR方法驗證。正確的轉化子于LB液體培養中培養以提取陽性克隆質粒并測序，測序正確的過表達質粒命名為con-pEC-gene。

1.4.2 敲除質粒構建

以谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647基因組中待敲除的突變基因上下游750 bp為模板設計引物。用引物Ko-gene-LF和Ko-gene-LR擴增上游同源臂，Ko-gene-RF和Ko-gene-RR擴增下游同源臂，引物Ko-gene-LF和Ko-gene-RR分別引入同源序列，便于和pK18 mobsacB載體進行同源重組。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ對質粒pK18 mobsacB進行酶切。后續操作同1.3.1，構建的敲除質粒命名為pK18-gene。

1.5 過表達和敲除菌株構建

1.5.1 過表達菌株構建

測序正確的過表達質粒con-pEC-gene分別通過電轉化的方法導入谷氨酸棒桿菌感受態，30 ℃培養24 h。培養的單菌落進行PCR驗證，構建SNP基因過表達重組菌株。

1.5.2 敲除菌株構建

敲除載體pK18-gene分別電轉化導入谷氨酸棒桿菌中。陰性對照為野生型菌株。30 ℃培養24 h后進行蔗糖敏感性篩選，長出的單菌落同時點在LBB+K和LBB+K+蔗糖的固體平板上。12 h后挑選在LBB+K上生長而LBB+K+蔗糖不長的單菌落，用LBB液體培養基過夜培養后轉接到LBB+蔗糖液體培養基中培養12 h。取1 μL菌液在LBB+蔗糖固體平板上劃線，長出的單菌落分別點在LBB和LBB+K固體平板上，挑選LBB板上長而LBB+K不長的單菌落進行PCR驗證或測序，構建SNP基因敲除菌株。

1.6 生長曲線測定

分別將SNP重組菌株接種于10 mL的LBB培養基中于30 ℃、220 r/min培養，12 h后轉接至100 mL的LBB培養基中，使初始OD600值為0.3。在30 ℃、220 r/min條件下培養36 h，一定時間取1次樣，測定OD600值。

1.7 熒光強度測定

將誘導型質粒pbtac-HT-11-EGFP轉化至構建的SNP重組菌株中，挑選單菌落于24孔板中(每孔含2 mL LBB培養基)。在30 ℃、220 r/min條件下培養12 h后，將20 μL菌液轉接至新的24孔板中并在每孔加入2 μL IPTG(24 mg/mL)，培養 24 h后測量熒光強度和OD600吸光值，計算單位熒光強度(FI/OD600)。

1.8 rtPTH外源蛋白表達和分析

選擇有價值的外源蛋白rtPTH進行SNP過表達和敲除重組菌株的進一步分析。將質粒pXMJ19-rtPTH電轉至over-2370和ko-973-974，后續操作同1.6。將rtPTH的發酵產物在12 000 r/min下離心1 min，并將上清液制成蛋白樣品，進行SDS-PAGE分析。

1.9 SWISS-MODEL預測分析

利用SWISS-MODEL軟件，輸入蛋白序列，搜索以匹配相關模板，選擇匹配性最高的模板，建立蛋白模型，并利用NCBI數據庫分析蛋白功能。

2 結果與分析

2.1 突變菌株的全基因組重測序分析

將誘變菌株的全基因組重測序結果進行整理分析后，結果顯示突變菌株中共有33個SNP和7個InDel。SNP包括位于編碼序列(CDS)中的22個非同義突變和位于基因間區域中的11個其他突變。其中編碼序列主要涉及5個基因(表3)，除GL002370編碼1種預測蛋白以外，GL000353，GL000477和GL002063編碼的蛋白質分別具有氧化還原酶，核酸內切酶和酪氨酸重組酶活性，GL002761編碼ATP依賴性Clp蛋白酶[9]。在位于GL000349～GL000350，GL000476～GL000477，GL000973～GL000974，GL002062～GL002063，GL002369～GL002370，GL002760～GL002761的基因間區域檢測到突變。因此，這些突變可能是增加外源蛋白質產量的相關靶基因，但其具體功能仍不清楚，需要進一步研究以探索這些基因與其表型變化之間的關系。

表3 全基因組重測序突變位點分析Table 3 The analysis for genome resequencing mutation site

2.2 SNP基因編碼蛋白的結構分析

從分析結果可知，SNP主要集中在GL000353，GL000477，GL002063，GL002370和GL002761這5個基因中，因此，該研究主要分析驗證這5個基因對于外源蛋白表達量的影響。首先通過NCBI數據庫分析了5個基因編碼的蛋白的結構，結果如圖1所示。GL000353編碼的蛋白共311個氨基酸，是短鏈型脫氫酶/還原酶。它包含1個NADB結構域，該結構域存在于許多代謝途徑的脫氫酶中，例如糖酵解和許多其他氧化還原酶[10]。GL000477編碼5-甲基胞嘧啶特異性限制性核酸內切酶McrA，共340個氨基酸，它是典型的限制性修飾(RM)系統中的一種酶，該系統可保護宿主免受外源DNA的侵害[11]。McrA包含1個His-Asn-His (HNH)基序，這個基序的第1個氨基酸在HNH核酸酶中的重要催化功能[12]。GL002063編碼特異性酪氨酸重組酶XerC，共315個氨基酸。Xer位點特異性重組系統可以把通過同源重組形成的二聚體染色體轉化為單體，它的C末端結構域在核心位點結合，切割和重新連接DNA鏈，而N末端結構域在很大程度上負責與同源臂結合[13]。GL002370編碼1個含有93個氨基酸的蛋白。GL002761編碼具有分子伴侶活性和ATP結合亞基的ClpC蛋白酶，由925個氨基酸構成。此蛋白酶有2個Clp-N結構域，1個ClpB-D2-small結構域以及1個UVR結構域[14]。

圖1 SNP基因編碼的蛋白結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the protein structures encoded by the SNP genes

2.3 SNP基因過表達和敲除重組菌株的構建

為了驗證SNP基因對于外源蛋白表達的影響，首先構建了SNP基因的過表達和敲除重組菌株。將SNP基因過表達質粒con-pEC-gene電轉入谷氨酸棒桿菌中，培養出的轉化子進行PCR驗證，結果如圖2-a所示，成功構建SNP基因過表達菌株：over-353，over-477，over-2063，over-2370，over-2761。將最后培養的敲除菌株進行PCR驗證，定點突變菌株進行測序。結果如圖2-b和圖2-c所示，成功敲除GL000353和GL002370，并且定點突變菌株測序正確。因此，成功構建了SNP基因敲除菌株：ko-353，ko-2370，ko-349-350，ko-476-477，ko-974-973。

a-SNP過表達菌株PCR驗證(M：2 000 marker，1～5：over-353，over-477，over-2063，over-2370，over-2761菌株PCR驗證)；b-敲除GL000353菌株PCR驗證(M：2 000 marker，1：陰性對照，2～4：GL000353敲除菌株)；c-敲除GL002370菌株PCR驗證(M：2 000 marker，1：陰性對照，2～7：GL002370敲除菌株)圖2 SNP基因過表達和敲除菌株PCR驗證Fig.2 The PCR verification of SNP genes overexpression and knockout strains

2.4 SNP基因過表達和敲除重組菌株生長曲線的測定

為了觀察SNP基因的過表達和敲除是否對菌株的生長有影響，進行了生長曲線的測定。結果如圖3所示，除了over-353，over-2761和ko-2370前期生長較為緩慢外，其余SNP基因的過表達和敲除對菌株的生長沒有太大影響。

a-SNP基因過表達菌株生長曲線；b-SNP基因敲除菌株生長曲線圖3 SNP基因過表達菌株和敲除菌株生長曲線Fig.3 Growth curve of SNP genes overexpression and knockout strains注：WT表示野生型(wild type)(下同)

2.5 SNP重組菌株對EGFP外源蛋白表達的影響

為了探究SNP基因重組菌株對于外源蛋白表達的影響，將EGFP作為報告蛋白以觀察熒光蛋白表達量的變化。將質粒pbtac-HT-11-EGFP分別電轉入SNP基因重組菌株，在多孔板中培養24 h后檢測熒光值。結果如圖4所示，在SNP過表達菌株中，除over-2761-EGFP的熒光值明顯降低以外，其余菌株SNP過表達菌株的熒光值都增加，且over-2370-EGFP的熒光值最高。在SNP敲除菌株中，ko-2370-EGFP和ko-349-350-EGFP熒光值明顯降低，而ko-973-974-EGFP的熒光值最高，其次是ko-353-EGFP，ko-476-477-EGFP。其中，over-2761-EGFP熒光值降低可能是GL002761編碼的Clp蛋白酶將EGFP外源蛋白降解所致。ko-353-EGFP和over-353-EGFP熒光強度均比野生型(wild type，WT)的高，且前者比后者的提升幅度更明顯，可能是由于過表達GL000353編碼的脫氫酶/還原酶加快了整個菌株的能量代謝流，使熒光蛋白的表達增加，而敲除該脫氫酶/還原酶可能改變能量代謝的流向，使能量更多的用于外源蛋白的合成。over-477-EGFP，ko-476-477-EGFP和ko-973-974-EGFP均使熒光值增強，而GL000477和GL000974都編碼5-甲基胞嘧啶特異性限制性核酸內切酶McrA，該蛋白與外源DNA的導入有關，對增強外源蛋白產量的機制還需要進一步研究。同樣over-2370-EGFP顯著增強了EGFP的表達，但其編碼的蛋白未知，還需要進一步探究。因此，基因GL002370以及GL000974確實與提高蛋白表達產量密切相關。

a-SNP過表達菌株熒光值；b-SNP敲除菌株熒光值圖4 SNP基因過表達和敲除菌株單位熒光強度Fig.4 Unit fluorescence intensity of SNP genes overexpression and knockout strains

2.6 SNP基因重組菌株對其他外源蛋白表達的影響

為了觀察SNP基因重組菌株對其他外源蛋白是否具有同樣的效果。分別選擇上述研究中對EGFP表達量最具影響的2株重組菌，over-2370和ko-973-974。在這2株SNP重組菌株中表達有價值的外源蛋白rtPTH，以驗證它們對其他外源蛋白表達量的影響。rhPTH是一種肽藥物，包含1～34個N末端氨基酸，已用于治療骨質疏松癥[15]。該研究使用了新的融合標簽Spy來促進rtPTH的穩定表達[16]。將質粒pXMJ19-rtPTH分別電導入over-2370和ko-973-974，構建over-2370-rtPTH和ko-973-974-rtPTH重組菌株。重組菌株分別誘導表達24 h后，結果如圖5所示。Spy-rtPTH蛋白分子質量為20.8 kDa，over-2370-rtPTH和ko-973-974-rtPTH均具有比WT有更高的產量。因此，在分析的SNP中，GL002370以及GL000974編碼的蛋白確實能夠使外源蛋白表達量明顯增加。

M-26610 marker，1-WT-rtPTH，2-ko-973-974-rtPTH，3-over-2370-rtPTH圖5 rtPTH外源蛋白表達驗證Fig.5 The verification for rtPTH heterologous protein expression

2.7 基因GL002370編碼的蛋白預測分析

基于以上蛋白表達結果的分析，基因GL000974和GL002370編碼的蛋白對提高外源蛋白產量影響較大，其中基因GL000974編碼的蛋白功能已知，而GL002370編碼的蛋白功能未知。因此分析了GL002370編碼蛋白的結構和功能。結果如圖6所示，經SWISS-MODEL分析，預測基因GL002370編碼的蛋白與谷氨酸棒桿菌的硫氧還蛋白依賴性砷酸還原酶最為相似，為α-螺旋的同源二聚體結構。硫氧還蛋白依賴性砷酸還原酶(ArsC)屬于砷酸鹽還原酶的第二家族，該家族使用硫氧還蛋白作為電子供體，在生物砷解毒途徑中起重要作用[17]。該家族在結構和功能上與低分子量蛋白質酪氨酸磷酸酶接近，并且具有磷酸酶活性。磷酸酶和激酶共同構成去磷酸化和磷酸化的調控系統，處于能量代謝的關鍵位置。而外源蛋白表達本身就是一個消耗大量能量的過程，因此推測這個基因可能影響蛋白生成的能量代謝，從而導致了外源蛋白產量的增加，但要明確over-2370影響蛋白產量的作用機理還需要進一步探究。

圖6 SWISS-MODEL預測基因GL002370編碼的蛋白結構圖Fig.6 The GL002370 protein structure predicted by SWISS-MODEL

3 結論與討論

在這項研究中，為了挖掘與蛋白表達相關的具體基因并獲得高產外源蛋白的谷氨酸棒桿菌菌株。首先基于全基因組重測序策略，分析出與蛋白表達相關的靶基因，并利用NCBI數據庫分析了蛋白的結構。其次構建了SNP基因過表達和敲除菌株，評價生長曲線以及SNP重組菌株中EGFP的表達水平。其中，SNP過表達菌株over-2370和ko-973-974使蛋白表達水平顯著增強。此外，我們選擇了有價值的外源蛋白rtPTH以驗證SNP基因重組菌株對其他外源蛋白的適用性。最后利用SWISS-MODEL軟件進行了基因GL002370編碼的蛋白的建模，并分析了蛋白的功能。

但是，在研究過程中存在一些需要進一步研究的問題。首先，目前只研究了單基因過表達和一些基因敲除對于蛋白表達的影響，其他基因的敲除和多基因的組合情況有待進一步研究。其次，基因GL002370編碼的具體蛋白以及導致蛋白產量增加的具體機制尚不明確，需要進一步深入研究。最后，提高外源蛋白產量除了宿主改造還有多個方面，例如優良的表達載體，表達元件等，可以探究不同組合之間的相互關系，以及對蛋白產量的影響[18-19]。這些研究都具有重要意義，要求研究人員進一步探索和發現新的目標。