噬菌體EC-p9和SM-p2內溶酶及穿孔素的特性及聯合抑菌作用

史東靈，解天慧，石慧

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

噬菌體(phage)是感染細菌的病毒，能特異性的感染和殺死宿主菌[1-2]。近年來噬菌體作為抗生素的代替劑得到了廣泛關注。與抗生素相比，噬菌體具有很多優勢。抗生素可以持續存在于土壤和其他環境中，從而增加細菌耐藥性進一步發生的風險[3]。噬菌體在沒有宿主菌的情況下不會在環境中持續很長時間，不會對環境造成嚴重污染[4]。而且噬菌體專門針對某一類細菌，具有特異性。

有研究表明少數噬菌體含有致病菌的毒力因子基因，并能隨噬菌體傳播[5]。另外，一些溶原性噬菌體編碼的毒力因子能將原本無害的細菌轉化為致病菌[1]。例如，與霍亂毒素相關的CTX噬菌體[6]。此外，溶原性噬菌體通過把DNA插入到宿主菌來傳播自身的DNA，也能從宿主菌中獲得并傳播基因片段，包括耐藥性基因[5]。噬菌體攜帶耐藥性基因在細菌之間的傳播，被認為是耐藥基因傳播、擴散或細菌獲得耐藥性基因的主要途徑之一[7-8]。內溶酶和穿孔素作為噬菌體裂解系統中的功能蛋白，能很好的解決噬菌體制劑存在的這些不足和缺陷。

噬菌體內溶酶(endolysin)是一種可以生物降解的蛋白質[9]，具有裂解細菌的能力，能從宿主細胞內部降解細菌細胞壁。內溶酶的肽聚糖靶標十分保守，是裂解細菌細胞壁肽聚糖層的主鍵。與抗生素相比，細菌很難對內溶酶產生抗性[10]。此外，內溶酶還具有穩定性好、作用速度快、細胞毒性低甚至沒有，以及能與現有抗生素協同等優點，使其成為有潛力的新型抗菌物質[11-12]。穿孔素(holin)能調控由內溶酶介導的宿主細胞裂解[13]。穿孔素的2個基本作用是在細胞膜上制造小孔以釋放內溶酶和決定感染周期的結束時間。穿孔素在宿主的細胞質中積累，累積到特定的濃度后在細胞膜上形成小孔，使內溶酶能夠通過細胞膜并降解肽聚糖[14-15]。與內溶酶不同，它對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有廣譜的非特異性抗菌活性[16]。與單純的內溶酶制劑相比，聯合使用穿孔素和內溶酶制劑是一種有效控制革蘭氏陽性菌的方法[17]。內溶酶和穿孔素可以直接作用于細胞壁或細胞膜，不需要經過噬菌體與細菌吸附、核酸注入和復制等過程，因此具有更高的效率[18-19]。并且這2種蛋白在保留噬菌體宿主特異性的前提下，具有比噬菌體更寬的宿主譜[20]。此外，內溶酶和穿孔素作為蛋白質，比噬菌體更容易被大眾接受。

在前期的工作中，本實驗室分離得到1株大腸桿菌(Escherichiacoli)O157∶H7噬菌體EC-p9和沙門氏菌(Salmonella)噬菌體SM-p2,表達純化了EC-p9和SM-p2的內溶酶和穿孔素(Lys 9、Hol 9和Lys 2、Hol 2)。本研究通過平板菌落計數法研究了這4種蛋白的裂解活性，評估這4種蛋白對溫度和pH的穩定性，以及細菌是否會對這4種重組蛋白產生抗性。由此來對噬菌體內溶酶和穿孔素的功能進行評價。為更好地利用內溶酶和穿孔素提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和噬菌體

大腸桿菌O157∶H7(NCTC 12900)和沙門氏菌(CGMCC 1.0090)分別購于英國菌種保藏中心和中國科學院微生物學研究所(北京)。單增李斯特菌(ATCC 19115)貯存在實驗室超低溫冰箱。噬菌體為本實驗室分離保存的烈性大腸桿菌 O157∶H7噬菌體EC-p9和烈性沙門氏菌噬菌體SM-p2。內溶酶和穿孔素為本實驗室表達純化的噬菌體EC-p9和SM-p2的內溶酶和穿孔素Lys 9、Hol 9和Lys 2、Hol 2。

1.1.2 試劑與培養基

LB肉湯、胰酪胨大豆肉湯培養基(trypticase soy broth，TSB)、胰酪胨大豆瓊脂培養基(tryptose soya agar，TSA)、BHI肉湯和PALCAM瓊脂，青島高科園海博生物技術有限公司；醋酸鈉、甘氨酸、磷酸、氯化鋅、碳酸鈉、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)、NaH2PO4、鹽酸、氯化鈉、氯化鈣、氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉，Gentihold；Tris、結晶紫，索萊寶生物技術有限公司。所有試劑均為分析純，所有水均為二次蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備

YX280A型高壓滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；SQP型電子天平、PB-10型pH儀，Sartorius；SW-CJ-FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；Mill-Q型純水系統，Merck Millipore；U410型超低溫冰箱，NEW BRUNSWICK Premium；BCD-649 W型普通冰箱，青島海爾股份有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司；THZ-D型恒溫搖床，江蘇太倉市實驗設備廠；5810R型冷凍高速離心機，Eppendorf；MX-F型微型渦旋混合儀、DK-98-II型萬用電爐、DHP-9272型恒溫培養箱，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的培養

從-80 ℃超低溫冰箱取出大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌分別平板劃線于TSA板，然后37 ℃過夜培養。取單菌落接種于20 mL的LB肉湯或BHI肉湯中，37 ℃，120 r/min培養16 h。

1.2.2 內溶酶和穿孔素的殺菌活性測定

1.2.2.1 殺菌活性

將過夜培養的大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌在8 000×g離心5 min，去除上清液。用Tris-NaCl緩沖液洗滌細菌沉淀2次，然后重懸于Tris-NaCl緩沖液，用Tris-NaCl緩沖液調整重懸液使OD600為1.0。將100 μL細菌懸浮液放入96孔板中。實驗組加入100 μL 已知濃度的親和純化的重組蛋白，其中Lys 9和Hol 9用于處理大腸桿菌O157∶H7；Lys 2和Hol 2用于處理沙門氏菌。對照組加入不含重組蛋白的緩沖液。將96孔板放置于37 ℃，每隔10 min測定細菌的菌落數，共60 min。酶的裂解活性計算入公式(1)所示：

(1)

1.2.2.2 重組蛋白的最小抑菌濃度

將過夜培養的大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌和單增李斯特菌用培養基稀釋到106CFU/mL。然后用培養基對Lys 9、Lys 2、Hol 9和Hol 2進行2倍比稀釋。取0.5 mL不同濃度的重組蛋白溶液分別與4.5 mL稀釋后菌液混合，加入試管。置于37 ℃培養箱中過夜培養。以沒有肉眼可見的細菌生長的最低濃度為重組蛋白的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。用不含重組蛋白的試管作為陽性對照，菌液出現明顯渾濁則表明實驗有意義。

1.2.3 重組蛋白的穩定性

將過夜培養的大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌在8 000×g離心5 min，用Tris-NaCl緩沖液洗滌2次并重懸于Tris-NaCl緩沖液，使OD600值為1.0，測定細菌數量為初始細菌數。Lys 9和Hol 9的穩定性用其對大腸桿菌O157∶H7的裂解活性進行評估；Lys 2和Hol 2則用其對沙門氏菌的裂解活性進行評估。

為了評價不同溫度對內溶酶和穿孔素酶活性的影響，將蛋白分別在4、25、37、50、60、70、80、90 ℃下處理15 min，在96孔板中加入150 μL的細胞重懸液和不同溫度下處理的50 μL終濃度為MIC的重組蛋白，將96孔板放置在37 ℃處理30 min，測定菌落數并計算酶的裂解活性。

為了評價不同pH對內溶酶和穿孔素酶活性的影響，pH 4.2和pH 5.2的20 mmol/L醋酸鈉、pH 6.2的10 mmol/L磷酸、pH 7.2的10 mmol/L PBS、pH 8.2的20 mmol/L Tris-HCl和pH 9.2的20 mmol/L甘氨酸-NaOH代替Tris-NaCl緩沖液重懸細菌細胞。在96孔板中加入150 μL的細胞重懸液和50 μL終濃度為MIC的重組蛋白，對照組用Tris-NaCl緩沖液重懸細胞。將96孔板放置在37 ℃處理30 min，測定菌落數并計算酶的裂解活性。

1.2.4 細菌對內溶酶和穿孔素抗性產生的分析

將大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌分別涂布在2個不同的TSA平板上。將10 μL Lys 9和Hol 9(濃度為MIC)滴加在含有大腸桿菌O157∶H7的TSA平板上。將10 μL Lys 2或Hol 2(濃度為MIC)滴加在含有沙門氏菌的TSA平板上。將平板在37 ℃倒置培養8 h，在不清晰抑菌圈的邊緣挑取菌落加入LB肉湯或BHI肉湯中在37 ℃、120 r/min培養8 h后，涂布在TSA平板。重復以上操作，共循環7代。并在第7代的基礎上挑取單菌落到LB或BHI培養基中連續培養5代(不與重組蛋白作用)，分別檢測內溶酶對每一代酶的裂解活性。

1.2.5 穿孔素對細菌細胞膜通透性的檢測

ONPG作為β-半乳糖苷酶的底物，可以用來檢測細菌懸液中β-半乳糖苷酶的活性，間接探究細菌細胞膜的通透性。將大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌在37 ℃培養至OD600值為0.6，5 000×g離心10 min，棄上清液，用0.05 mol/L NaH2PO4緩沖液洗滌3次后重懸，使其OD600值約為0.2。用終濃度為2 MIC的重組蛋白進行處理后，取5 mL菌液12 000×g離心15 min。然后將1 mL上清液與4 mL 0.05 mol/L ONPG溶液混勻，在37 ℃水浴反應30 min。隨后加入5 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應，并測量OD420值。酶活力計算如公式(2)所示：

β-半乳糖苷酶活力/(U·mL-1)=(OD420×V)/(t×Vs×0.004 5)

(2)

式中：V，反應混合液體積，5 mL；t，反應時間，30 min；Vs，樣品體積，5 mL；0.004 5，消光系數,mL/nmoL。換算后如公式(3)所示：

β-半乳糖苷酶活力/(U·mL-1)=OD420×7.407 4

(3)

1.2.6 內溶酶和穿孔素的聯合抑菌作用

選擇大腸桿菌O157∶H7為底物，對重組內溶酶Lys 9、穿孔素Hol 9及其組合物的殺菌能力進行檢測分析。將過夜培養的大腸桿菌O157∶H7菌液用Tris-NaCl緩沖液洗滌重懸，并調節OD600值至0.8～1.0；取450 μL菌液分別加入50 μL終濃度為2 MIC 的Lys 9或Hol 9；取450 μL菌液加入50 μL Lys 9和Hol 9的組合物，Lys 9和Hol 9的終質量濃度分別為2.5、1.4 mg/mL，在37 ℃培養1 h后測定菌落數。

選擇沙門氏菌為底物，對重組內溶酶Lys 2、穿孔素Hol 2及其組合物的殺菌能力進行檢測分析。方法如上所述，內溶酶Lys 2和穿孔素Hol 2組合物加入菌液后，Lys 2和Hol 2的終濃度分別為1.2 mol/mL和1.0 mg/mL。

1.2.7 統計分析

本研究所有實驗均重復3次。本研究中所得數據在Excel 2016中統計，所有細菌菌落數(CFU/mL)和噬菌體滴度(PFU/mL)轉化為以10為底對數，單位分別為lgCFU/mL和lgPFU/mL。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表，運用ANOVA進行單因素方差分析。所有數據均采用SPSS 22.0(Duncan)進行顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的殺菌活性測定

利用純化后的Lys 9、Hol 9、Lys 2、Hol 2驗證其在體外的裂解能力。結果如圖1所示，Lys 9、Hol 9、Lys 2和Hol 2的裂解活性分別在30、20、40、30 min后逐漸保持穩定，最高的裂解活性分別為61.348%、81.120%、74.251%和83.356%。

圖1 重組蛋白的裂解活性Fig.1 Lytic activity of recombinant protein

2.2 重組蛋白的MIC

重組蛋白對大腸桿菌O157∶H7，沙門氏菌和單增李斯特菌的MIC如表1所示。4種重組蛋白MIC不同，其中Lys 9對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.25 mol/mL，對單增李斯特≥0.125 mol/mL；Hol 9對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.14 mol/mL，對單增李斯特≥0.28 mol/mL；Lys 2對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.12 mol/mL，對單增李斯特≥0.06 mol/mL；Hol 2對大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌的MIC≥0.10 mol/mL，對單增李斯特≥0.20 mol/mL。Lys 9和Lys 2對單增李斯特菌的MIC小于其他2種菌，這是因為單增李斯特菌屬于革蘭氏陽性菌。與革蘭氏陰性菌相比，革蘭氏陽性菌沒有細胞壁外膜的阻隔，內溶酶更容易與細菌細胞壁的肽聚糖接觸并導致細菌死亡[21-22]。

表1 重組蛋白的MIC 單位：mol/mLTable 1 The MIC of recombinant protein

2.3 溫度對重組蛋白穩定的影響

重組蛋白用不同的溫度處理后，對細菌的裂解活性如圖2所示。4種重組蛋白在70、80、90 ℃處理15 min后完全喪失裂解活性。4、25、37 ℃處理15 min后，Lys 9 和Hol 9的裂解活性沒有顯著性差異(P>0.05)；隨著處理溫度升高到50、60 ℃，Lys 9的裂解活性與4 ℃相比顯著降低了17.00%和33.67%(P<0.05)；在50 ℃處理15 min后，Hol 9的裂解活性為44.15%，與4 ℃相比降低了34.68%；在60 ℃處理15 min后，Hol 9完全喪失裂解活性。4、25 ℃處理Lys 9 和Hol 9，其裂解活性沒有顯著性差異(P>0.05)，但隨著溫度從25 ℃上升至60 ℃，Lys 9的裂解活性從70.34%降低到42.65%；Hol 2的裂解活性從80.94%降低到13.23%。上述結果表明，在4、25、37 ℃時，這4種蛋白的裂解活性穩定；在50 ℃時，這4種蛋白未完全失活，仍然具有裂解細菌的能力。

圖2 溫度對重組蛋白穩定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of recombinant protein注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 pH對重組蛋白穩定性的影響

重組蛋白在不同pH環境中的裂解活性如圖3所示。Lys 9、Hol 9和Lys 2在pH為8時，裂解活性最強，分別為62.62%、81.12%和80.00%，Hol 2在pH為7的環境下裂解活性最強為83.36%，且這4種重組蛋白的裂解活性在pH為7和8時，沒有顯著性差異(P>0.05)。Lys 9和Lys 2在pH為4～10時較為穩定，且在pH為3時，Lys 9和lys 2依然保持裂解活性，分別為22.61%和4.47%；Hol 9和Hol 2在pH為3時完全喪失列裂解活性，且在pH為4時，裂解活性僅為1.35%和9.01%；pH ≥11時，Hol 9和 lys 2 喪失裂解活性；總的來說，這4個重組蛋白對pH有較高的穩定性且在中性和弱堿性條件下表現出最高的裂解活性。

圖3 pH對重組蛋白穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of recombinant protein

2.5 細菌對重組蛋白產生抗性的情況

重組蛋白具有很寬的裂解譜和很強的殺菌能力，預示著其應用前景十分廣泛。但宿主菌在進化的過程中是否會對4種重組蛋白產生抗性，還需要進一步驗證。如圖4所示，在連續傳代12代后，每一代的細菌對4種重組蛋白的敏感性都沒有顯著降低(P>0.05)，表明在12代內細菌不會對Lys 9、Lys 2、Hol 9和Hol 2產生抗性。

圖4 細菌對重組蛋白的抗性Fig.4 The bacteria resistance to recombinant proteins

2.6 穿孔素對細菌細胞膜通透性檢測

穿孔素是在宿主的細胞質膜中形成非特異性的孔或損傷，當細胞膜受到破壞損傷時，一部分細胞內合成β-半乳糖苷酶會泄漏到細胞外。該酶能分解ONPG，生成黃色的鄰硝基酚，然后通過溶液顏色變化檢測β-半乳糖苷酶活性。因此，細胞外β-半乳糖苷酶的酶活性可以作為一個參數用來間接評價細胞膜通透性是否發生變化。結果如圖5所示，經Hol 9和Hol 2處理的大腸桿菌和沙門氏菌懸液中的OD600值顯著高于未處理組(P<0.05)。這表明，這兩種穿孔素處理的菌懸液中的β-半乳糖苷酶的酶活力明顯高于未處理組，β-半乳糖苷酶從胞內流出。因此可以推斷，Hol 9和Hol 2影響了細菌細胞膜的通透性。

圖5 穿孔素對細菌細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of holin on membrane permeability

2.7 內溶酶和穿孔素的聯合抑菌作用

本研究中4種重組蛋白都具有抑菌能力，見圖6。本實驗通過平板菌落計數實驗測定Lys 9和Hol 9聯合應用對大腸桿菌的抑制作用和Lys 2和Hol 2聯合應用對沙門氏菌的抑制作用。圖6顯示，Lys 9和Hol 9聯合應用1 h 后，大腸桿菌的數量下降了約3 lgCFU/mL，顯著高于單獨使用Lys 9或Hol 9(P<0.05)；Lys 2和Hol 2聯合應用1 h 后，沙門氏菌的數量下降了約4 lgCFU/mL，顯著高于單獨使用Lys 2或Hol 2(P<0.05)。這表明穿孔素和內溶酶在抑制病原菌上表現出協同作用。

圖6 內溶酶和穿孔素的聯合抑菌作用Fig.6 Bacteriostatic effect of endolysin and holing

3 結論

生化特征表明Lys 9和Lys 2具有中性或者弱堿性，因為在中性或弱堿性條件下，這2種蛋白活性相對較高。Lys 9、Hol 9、Lys 2和Hol 2在4 ℃時表現出較高的活性，然而，在60 ℃時還具有活性，表明這4種蛋白具有熱穩定性，其在預防和治療病原細菌方面的實際應用，具有明顯的優勢。內溶酶已經應用于控制家禽的體外或體內革蘭氏陽性致病菌的感染；能有效去除頑固的生物被膜[23]；能控制牛奶和水果中的致病菌[24]。這4種蛋白具有廣譜的殺菌活性和很強的殺菌能力，使其可以作用于多種病原菌，能夠來預防食源性致病菌引起的疾病。穿孔素和內溶酶還展現出協同抑菌作用。細菌很難對噬菌體內溶酶和穿孔素產生抗性，這主要是由于內溶酶和穿孔素作用的細菌細胞壁和細胞膜的結構相對保守不容易產生變異。這些數據表明內溶酶和穿孔素作為一種新型的抑菌物質具有很大的潛力和巨大發展空間。