四川黃酒麥曲發酵過程中理化特性及微生物多樣性變化研究

唐鰻秋，夏玙，覃鳳陽，吳正云，張文學,2*

1(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610065)2(四川大學錦江學院 白酒學院，四川 眉山，620860)

黃酒是中國傳統的發酵酒(酒精體積分數8%～15%)，在中國已有5 000多年的歷史，其風味獨特且營養豐富[1]。我國黃酒產地多，分布廣，品類繁多，目前黃酒生產主要采用傳統工藝(人工處理)和機械工藝(使用設備)2種工藝，通常發酵25～40 d，貯存6～12個月[2]。中國黃酒講究“以麥制曲，用曲釀酒”[3]，麥曲是傳統黃酒釀造的重要原料之一，被譽為黃酒之“骨”。麥曲含有非常豐富的酶系，微生物是麥曲的重要組成部分，對黃酒的品質和風味起到了非常重要的作用，主要包含各類絲狀真菌、細菌和酵母菌[4]。想要不斷提高麥曲的品質，則需進一步研究其中的微生物，許多科研單位和黃酒釀造從業者也對其進行了大量的研究。崔夢君等[5]運用PCR-DGGE與MiSeq高通量測序技術相結合的方法分析了黃酒熟麥曲細菌多樣性，結果顯示芽孢桿菌屬(Bacillus)與魏斯氏屬(Weissella)是優勢細菌屬；JI等[6]利用高通量測序技術對麥曲中的絲狀真菌進行了研究，發現絲狀真菌在不同的麥曲和不同的發酵階段存在差異，且在各發酵階段中，曲霉屬(Aspergillus)一直為優勢絲狀真菌屬。目前，關于黃酒麥曲的微生物群落結構國內已有部分相關研究報道[5-8]，但總體而言還比較淺顯片面，而且揭示麥曲發酵過程微生物群落演替規律的研究還鮮有報道。本研究以四川黃酒麥曲發酵過程曲為研究對象，采用Illumina MiSeq PE300平臺對細菌16S rDNA V3～V4區和真菌ITS區序列進行分析，旨在較為全面地解析四川黃酒麥曲發酵過程中微生物種群結構的動態變化規律，探索其與理化性質之間的相關性，為后續篩選功能微生物，優化黃酒麥曲生產工藝并提高麥曲品質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒麥曲，四川省某黃酒廠制曲車間；氫氧化鈉、無水乙酸鈉、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、甲醛溶液(37%～40%)(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美國Omega公司；引物，上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司；Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酒麥曲制備工藝與樣品采集

制曲工藝：以小麥為原料采用固態發酵的方式，在適宜的氣溫和水分條件下，小麥經過篩選、軋碎、拌水、踩曲、壓制成型后，堆積于曲房內保溫培養并進行自然接種，期間翻曲1～2次，經7 d左右的固態發酵而成。

樣品采集：從發酵過程初始起每天取樣1次，共計8 d、8次(依次標記為FH1～FH8)，貯藏期取樣1次(第12天，標記為FHC)，共計9個樣品。

1.3.2 理化指標分析檢測

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[9]測定樣品中水分、糖化力、液化力和酸度。采用酒母醪中標準葡萄糖液反滴定的還原糖測定法[10]。

1.3.3 DNA提取及測序

采用試劑盒提取麥曲微生物宏基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結果，用NanoDrop2000檢測濃度和純度；使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rDNA基因V3～V4區域擴增，20 μL PCR體系包括：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 三磷酸脫氧核糖核苷酸(2.5 mmol/L)，0.8 μL正反向引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶(5 μmol/L)，0.2 μL BSA，10 ng DNA模板，補ddH2O至20 μL；使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′)對真菌ITS區域擴增，20 μL PCR體系包括：2 μL 10×緩沖液，2 μL三磷酸脫氧核糖核苷酸(2.5 mmol/L)，0.8 μL正反向引物(5 μmol/L)，0.2 μL rTaq聚合酶，0.2 μL 牛血清白蛋白(bovine albumin，BAS)，10 ng DNA模板，補ddH2O至20 μL；擴增參數：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環30次；72 ℃延伸10 min；使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，并純化回收。送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，用Illumina MiSeq PE300平臺測序。

1.3.4 測序數據分析

對原始數據進行質量控制與預處理，得到有效序列[11]，用于后續分析。使用UPARSE[12]軟件將相似性>97%的序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類。用QIIME[13]計算Alpha多樣性，根據Ace、Chao1和Shannon指數對麥曲曲樣中的微生物豐富度和多樣性進行分析。通過BLAST比對，獲得細菌和真菌分別在門和屬水平下的分類情況[14]。用R語言的Vegan軟件包進行典型對應分析(canonical correspondence analysis，CCA)并繪圖。使用Origin 2018軟件對麥曲樣品的理化性質變化和其中優勢微生物進行柱狀圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 麥曲發酵過程的理化生化指標變化

麥曲發酵過程中溫度的變化情況見圖1-a。成型麥曲在曲房堆積時，鋪上稻草以及及時的關門封窗措施會起到一定的保溫作用，隨著麥曲中微生物的生理代謝活動開始頻繁，麥曲品溫迅速增加，在麥曲入房堆積的第5天，達到了最高品溫(55 ℃)。在整個發酵過程中, 麥曲品溫始終高于36 ℃。圖1-b是水分、糖化力、液化力、還原糖和酸度的變化情況。麥曲水分隨發酵進行而逐漸降低，跟大曲發酵[15]相似，隨著自然發酵溫度的增加，水分不斷汽化而減少，但成熟期麥曲的水分略有上升，這可能是由貯存環境的排濕處理和密閉性較差所導致的。麥曲的品溫和水分為其發酵過程中微生物的生長繁殖與生理代謝提供了條件。在發酵第2天左右，糖化力達到887 U左右，隨后下降，可能是因為該階段曲霉屬等多種利于產酶的絲狀真菌生長代謝緩慢，糖化酶產量減少；在發酵第4天后，糖化力又大幅上升，最后趨于穩定在992 U左右。液化力在發酵第4～7天有一定波動，推測與微生物的菌群演替、生長繁殖有關，但整體呈上升趨勢，最終穩定在0.38 U左右。還原糖含量隨著糖化酶活力變化而變化，可能是因為麥曲中大量淀粉經α-淀粉酶及糖化酶分解轉化為葡萄糖等，所以還原糖含量與糖化力有較大關聯。麥曲的酸度主要來自微生物的有機酸代謝以及對淀粉、蛋白質等的降解[16]。發酵第3天時酸度達到峰值，這可能是由于此時微生物正在大量繁殖并產生了大量酸類代謝物。發酵第3天后，酸度又下降到0.55 mmol/10g左右，最后穩定在0.57 mmol/10g左右。

a-溫度；b-水分、液化力、糖化力、還原糖含量、酸度圖1 黃酒麥曲發酵過程中理化指標的變化情況Fig.1 Changes of physicochemical indexes during the fermentation of Huangjiu wheat Qu

2.2 麥曲微生物的Alpha多樣性分析

由表1可知，發酵過程中麥曲的細菌OTU數逐漸上升；真菌OTU數呈先降后增再降的趨勢，最終整體增加。所有樣本的Coverage指數均大于0.999，說明樣本文庫中序列的覆蓋率高。Ace指數和Chao1指數評估物種豐富度，Shannon指數評估物種均勻度和多樣性。麥曲發酵前2 d的細菌Ace指數和Chao1指數較小，隨后大幅上升，這表明麥曲在發酵初期細菌群落豐富度最低，經過一段時間的發酵作用后菌群豐富度上升。麥曲的細菌Shannon指數先升后降再上升，最終總體上升，這表明麥曲隨著發酵的結束，其細菌群落多樣性最終上升。同理可知，麥曲在發酵前期真菌群落豐富度較低，經過一段時間的發酵作用后菌群豐富度總體上升，且麥曲隨著發酵的結束，其真菌群落多樣性最終上升。

表1 黃酒麥曲發酵過程樣品的細菌和真菌Alpha多樣性指數Table 1 Analysis of bacterial and fungal Alpha diversity ndexes of fermentation process samples of Huangjiu wheat Qu

2.3 麥曲微生物群落結構分析

麥曲發酵過程中的細菌群落結構見圖2。由圖2-a可知，在門水平上，黃酒麥曲在整個發酵過程中，變形菌門(Proteobacteria)(21.69%～70.65%)和厚壁菌門(Firmicutes)(28.94%～58.69%)一直為優勢菌門。在發酵后期，變形菌門相對豐度比例相對下降，厚壁菌門相對豐度比例相對上升，且藍藻細菌(Cyanobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)逐漸增多，但最終的成品曲(FHC)中厚壁菌門(44.10%)和變形菌門(21.05%)仍為相對優勢菌，這與崔夢君等[5]的報道一致。原因可能是變形菌門中的部分好氧菌可能在低氧、高溫的環境中難以生存，而厚壁菌門中的芽孢桿菌則可以適應這種惡劣的環境[17]。

由圖2-b可知，在屬水平上，黃酒麥曲發酵過程樣品的細菌群落多樣性波動上升，其變化情況與上述多樣性指數一致。在發酵前期，葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、Kosakonia、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬為相對優勢菌，尤其在發酵第5天(頂溫)時，群落物種最為豐富。在發酵后期，發酵溫度逐漸下降，細菌群落組成發生顯著改變，芽孢桿菌屬和羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)占相對優勢，最終形成以芽孢桿菌屬(38.38%)、不動桿菌屬(Acinetobacter，2.01%)、代爾夫特菌(Delftia，1.80%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium，1.73%)、葡萄球菌屬(1.67%)、氣單胞菌屬(Aeromonas，1.45%)、Sulfuricurvum(1.45%)、Cyanobium_PCC-6307(1.41%)和黃桿菌屬(Flavobacterium，1.18%)為主的細菌群落。劉蕓雅等[18]利用Illumina Miseq測序平臺對紹興黃酒麥曲的細菌群落結構進行分析，結果發現麥曲中優勢菌屬為芽孢桿菌屬(58.65%)，與本研究結論一致。芽孢桿菌屬的高豐度的形成可能是由于其具有一定的耐高溫、耐酸、耐堿性和復雜酶系的協同作用，在麥曲堆放過程中高達55 ℃的環境下，大部分微生物的生長繁殖受抑制，但芽孢桿菌屬仍能以芽孢的方式生存[19]，且在較高溫度下生長的菌株一般具有較高的孢子耐熱性[20]。

a-門水平；b-屬水平圖2 門水平及屬水平上黃酒麥曲發酵過程中細菌群落結構Fig.2 Bacterial community structure during the fermentation of Huangjiu wheat Qu based on phylum and genus level

麥曲發酵過程中的真菌群落結構見圖3。由圖3-a可知，在門水平上，黃酒麥曲在整個發酵過程中，子囊菌門(Ascomycota，59.23%～99.99%)一直為絕對優勢菌門；在發酵后期，擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉亞門(Mucoromycota)逐漸增多，僅次于子囊菌門共同成為絕對優勢菌，這與凌夢螢[21]的研究結果一致。在屬水平上(圖3-b)，在整個發酵過程中，曲霉屬(42.72%～99.70%)一直都是絕對優勢菌屬。在發酵起始階段，有足夠的氧氣和營養物質供給，因此形成一個相對復雜的真菌群落結構；自發酵開始，真菌微生物數量逐漸減少，這可能是由于細菌在繁殖過程中釋放出一些可能會抑制真菌生長的物質(例如乙酸、乳酸等)；隨著進一步發酵，一些真菌在適應環境后，可利用殘留的營養物質或其他微生物的代謝產物生長，因此真菌微生物數量又逐漸增多；在發酵后期，真菌群落組成發生顯著改變，多樣性較豐富，與上述多樣性指數一致，最終形成以曲霉屬(42.73%)、Apiotrichum(28.12%)、Cutaneotrichosporon(10.52%)、釀酒酵母(Saccharomyces，6.37%)、棒束孢屬(Isaria，6.10%)、奧默柯達菌屬(Kodamaea，1.39%)為主的真菌群落。曲霉屬等多種絲狀真菌在黃酒發酵過程中可分泌多種有利于淀粉糖化以及蛋白質分解的酶類，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等[22]。其中，糖化酶活力在第7天時最高, 達到了1 030 U(圖1-b)。

a-門水平；b-屬水平圖3 門水平及屬水平上黃酒麥曲發酵過程中真菌群落結構Fig.3 Fungal community structure during the fermentation of Huangjiu wheat Qu based on phylum and genus level

2.4 細菌群落與理化因子的關聯性分析

CCA方法[23]是生物多樣性多元統計的常用方法之一。選擇黃酒麥曲樣品中相對豐度在前10位的細菌群落與糖化力、液化力、還原糖含量和酸度等理化因子進行CCA。如圖4所示，酸度與液化力之間夾角為鈍角，說明2個指標之間呈負相關；糖化力與液化力之間夾角為銳角，說明2個指標之間呈正相關，具有協同效應；同理可知，還原糖與糖化力、液化力均呈正相關，與酸度呈負相關。不同樣品間的關系主要有：FH1、FH3和FH5之間相關性較大，與FH7和FHC均差異較大；FH7與FHC之間差異較大。不同物種間的關系主要有：葡萄球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、Kosakonia和腸桿菌屬等微生物呈正相關，與芽孢桿菌屬等微生物呈負相關。物種和理化因子間的主要關系有：葡萄球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、Kosakonia和腸桿菌屬與酸度呈正相關，與糖化力、液化力和還原糖含量呈負相關；芽孢桿菌屬與糖化力、液化力和還原糖含量呈正相關，與酸度呈負相關。由此說明，麥曲中微生物的種群結構對麥曲理化指標具有顯著影響。

圖4 黃酒麥曲發酵過程中細菌群落與理化因子的CCAFig.4 The CCA between bacterial community and physicochemical factors during the fermentation of Huangjiu wheat Qu

3 結論

本研究以四川黃酒麥曲發酵過程酒曲為研究對象，通過高通量測序技術探究了四川黃酒麥曲發酵過程中的細菌多樣性和真菌多樣性，對細菌群落而言，葡萄球菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia為發酵前期的主要菌屬，在發酵第5天(頂溫)時，群落物種最為豐富，隨著發酵繼續進行，在發酵后期的發酵溫度逐漸下降，細菌群落組成發生顯著改變，最終芽孢桿菌屬成為相對優勢菌屬；對真菌群落而言，在整個發酵過程中，曲霉屬一直都是絕對優勢菌屬，隨著發酵的進行，曲霉屬的豐度略有下降，最終形成以曲霉屬、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon、釀酒酵母、棒束孢屬和奧默柯達菌屬為主的真菌群落。此外，對黃酒麥曲發酵過程中的理化特性變化情況進行了分析，總體而言，隨著黃酒麥曲發酵結束，其水分含量下降，而糖化力、液化力、還原糖含量和酸度均上升。由CCA可知麥曲中微生物的種群結構與麥曲理化指標存在明顯關聯，且還原糖含量與微生物物種分布相關程度最大，芽孢桿菌屬對麥曲理化指標的影響較大。本研究探究了黃酒麥曲在不同發酵階段中細菌和真菌群落及理化特性的變化規律及相互關系，有助于構建關于黃酒麥曲微生物多樣性的系統認識體系，后續可通過分析發酵過程中微生物具體代謝途徑和機理來探究其對黃酒麥曲及黃酒的風味和品質的作用，以期為黃酒工業化發展提供理論基礎。