漠河藍果忍冬多酚成分鑒定及其體外生物活性分析

朱冠冰，喬錦莉，呼延文靜，劉佩，張妍,3*，霍俊偉,3*

1(寒地小漿果開發利用國家地方聯合工程研究中心，黑龍江 哈爾濱，150030)2(東北農業大學 園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱，150030)3(東北農業大學 農業部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

藍果忍冬(LoniceracaeruleaL.)又名藍靛果，是國際上新興的“第三代果樹”中十分重要的樹種，具有很高的營養價值[1]。在我國主要分布于東北、西北和華北地區，野生藍果忍冬種質資源在大興安嶺漠河地區十分豐富，目前已經得到一定程度的開發利用，具備較好的開發前景。

多酚廣泛存在于自然植物界，如蔬菜、水果、種子中，天然多酚常以與一個或多個與羥基相關的糖殘基的共軛形式存在，可分為黃酮類化合物、酚酸類化合物、對苯二酚、木質素等。其中黃酮類化合物分布最廣，而花色苷是黃酮類化合物中最普遍的一種。藍果忍冬內富含多酚類物質，花色苷是其重要組成部分。據報道，富含花色苷的野生藍莓及藍莓均能有效清除自由基，具有較強的抗氧化能力[2]，而且藍果忍冬的多酚含量與抗氧化能力呈正相關關系[3]。藍果忍冬因富含多酚類物質，可以很好地抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶，對于Ⅱ型糖尿病有明顯的抑制作用，因此是天然降血糖藥的主要來源[4]。藍果忍冬含量最高的花色苷——矢車菊-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)在抗乳腺癌、抗肝癌、抗肺癌等抗癌方面[5-6]，抗肺炎、抗肝炎、抗腸胃炎、抗牙齦炎、抗眼部炎癥等[7-8]抗炎方面都有顯著的生理功效。

目前，常用檢測植物多酚的方法主要有HPLC、GC-MS、分光光度法、電噴霧萃取電離以及核磁共振技術等。其中HPLC法在果蔬多酚分離和鑒定中首選且應用廣泛，液相-質譜聯用/質譜是測定不同多酚含量的最佳方法以及分析其結構的最有效方法[9]。本研究通過固相萃取技術(solid phase extraction，SPE)分離純化多酚組分，利用高效液相色譜-電噴霧質譜法研究漠河藍果忍冬花色苷以及非花色苷多酚的種類、分子結構和相對含量，同時分析了抗氧化活性、抗淀粉酶活性、抗脂肪酶活性，對漠河藍果忍冬資源深入開發提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍果忍冬果實采集自漠河市。采集的材料凍干后研磨成粉末，過80目篩放于-20 ℃冰箱內保存后，用作后續分析。

玉米淀粉、福林酚試劑、沒食子酸標品(gallic acid，GA，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、色譜級乙腈、甲酸、醋酸銨，美國Sigma公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基氯代甲烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、熒光素鈉、2,2′-偶氮二(2-甲基丙脒) 二鹽酸鹽、2,4,6-三三嗪基-S-三嗪、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O，北京博奧拓達科技有限公司；對硝基苯基磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

LL3000凍干機，美國賽默飛世爾公司；Epoch 2酶標儀，美國BioTek公司；SPE固相萃取儀，上海安普公司；HPLC-20 AD高效液相色譜儀，日本島津公司；液相色譜質譜聯用儀(HPLC-TOF/MS2)，美國AB SCIEX公司；Luna C18分析色譜柱(150 mm×46 mm×5 μm)，美國Phenomenex公司；Sep-Pak C18固相萃取柱，愛爾蘭Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍果忍冬果實多酚提取及含量測定

稱取10 g凍干果粉，加入一定濃度的甲醇進行提取，超聲提取后放入冷凍離心機(8 000 r/min，4 ℃，10 min)中離心得上清液。上述條件再次萃取，合并2次上清液旋蒸(40 ℃)濃縮，得到多酚粗提液。參考Folin-Ciocalteu法[10]稍作修改，測定樣品765 nm吸光值，用0～100 μg/mL的沒食子酸(gallic acid，GAE)溶液繪制標準曲線，標準曲線為y=5.381 5x+0.000 3(R2=0.999 1)。藍果忍冬的總酚含量表示為mg GAE/100g DW。

1.3.2 總花青素測定

參考pH示差法[11]并稍作修改，2種緩沖液(氯化鉀和乙酸鈉緩沖液)與花青素濃縮液混合于96孔板，在520和700 nm處分別讀取吸光度，總花青素通過公式(1)、公式(2)進行計算，藍果忍冬的總花青素表示為mg C3G/g DW。

A=(A510 nm-A700 nm) pH1.0-(A510 nm-A700 nm) pH4.5

(1)

(2)

式中，A，吸光度；MW，C3G的分子質量(449.2)；DF，稀釋倍數；ε，摩爾吸光系數(26 900)。

1.3.3 多酚的提取、純化

通過固相萃取將多酚粗提液分離、濃縮，參考KIM等[12]的方法，將3個組分的洗脫液于35 ℃下旋蒸濃縮，過0.22 μm的有機濾膜后保存于-20 ℃冰箱中，用于后續的鑒定于分析，同時測定濃度。

1.3.4 多酚的HPLC-PDA和HPLC-TOF/MS2鑒定

花色苷的鑒定(二元流動相)：A相(酸水：5%乙腈，1%甲酸，體積分數)，B相(乙腈)。洗脫程序如表1所示，流速0.6 mL/min，柱溫25 ℃，花色苷檢測波長為520 nm。

表1 花色苷鑒定的洗脫程序Table 1 Elution procedure for identification of anthocyanins

非花色苷多酚的鑒定(三元流動相)：A相(5 mmol/L醋酸銨)；B相(20% A相溶于乙腈)；C相(60 mmol/L甲酸)。洗脫程序如表2，流速為0.6 mL/min，柱溫25 ℃，非花色苷多酚檢測波長為280 nm。

表2 非花色苷多酚鑒定的洗脫程序Table 2 Elution procedure for identification of non-anthocyanin polyphenols

TOF質譜儀通過ESI進行分析，并通過Analyst?TF 1.7.1 Software進行控制，流動相與上述一致。

1.3.5 多酚提取液的抗氧化能力測定

(1)DPPH法測定

參考BRANDWILLIAMS等[13]的方法測定。以0.1～0.8 mmol/L的Trolox建立標準曲線：y=0.160 8x-10.928(R2=0.996 9)，并將y值代入到標準曲線中進行計算，并與質量濃度(mg/mL)進行換算，結果表示為1 g(DW)樣品中的μmol Trolox當量(TEAC)，單位為μmol TE/g DW。

(2)抗氧化能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)測定

參考HUANG等[14]的方法并稍加修改，適量稀釋的樣品與熒光素溶液混合，再加入偶氮二異丁脒鹽酸鹽溶液，37 ℃的條件下測定2 h內的熒光值。以0.01～0.2 mmol/L的Trolox建立標準曲線：y=0.024 9x-24.717(R2=0.994 6)，并將y值代入到標準曲線中進行計算，并與質量濃度(mg/mL)進行換算，結果表示為1 g(DW)樣品中的μmol Trolox當量(TEAC)，單位為μmol TE/g DW。

(3)鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)測定

參考NAYAK等[15]的方法并稍做修改，在593 nm下測量空白讀數后再與樣品和去離子水混合，在37 ℃，593 nm處記錄第30 min的讀數，作為檢測的吸光度。以0.1～1.0 mmol/L的FeSO4·7H2O建立標準曲線：y=0.003x+0.018 6(R2=0.992 2)，并將質量y值代入到標準曲線中進行計算，并與質量濃度(mg/mL)進行換算，結果表示為1 g(DW)樣品中的μmol FeSO4當量(TEAC)，單位為μmol TE/g DW。

(4)ABTS法

ABTS的測定參考RE等[16]的方法。以0.05～0.5 mmol/L的Trolox建立標準曲線：y=0.718x+0.667 6(R2=0.999 4)，并將y值代入到標準曲線中進行計算，并與質量濃度(mg/mL)進行換算，結果表示為1 g(DW)樣品中的μmol Trolox當量(TEAC)，單位為μmol TE/g DW。

1.3.6 多酚提取液對脂肪酶的抑制活性

取凍干粉與二氯甲烷(dichloromethane，DCM)進行混合與離心，得到DCM提取液。96孔板內加入樣品、脂肪酶和pNPP溶液在410 nm下讀取1 h內混合物的吸光度，得到不同樣品對脂肪酶抑制的動力學曲線。對豬胰脂肪酶活性的抑制率計算入公式(3)所示：

(3)

式中：AUC1,樣品對脂肪酶抑制曲線下面積；AUCCK，對照對脂肪酶抑制曲線下面積。

1.3.7 多酚提取液對淀粉酶的抑制活性

參考LIU等[17]的方法測定抗α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。玉米淀粉和磷酸緩沖液混合，在磁力攪拌機中加熱攪拌直至半透明狀態。然后將樣品或磷酸緩沖液(作為對照)、α-淀粉酶(α-葡萄糖苷酶)和糊化的玉米淀粉混合于660 nm處讀取2 h內混合物的吸光度，得到漠河藍果忍冬多酚粗提液對淀粉酶活性的抑制動力學曲線，對淀粉酶抑制率計算如公式(4)所示:

(4)

式中：AUC1，樣品對淀粉酶抑制曲線下的面積；AUCCK，對照對淀粉酶抑制曲線下的面積。

1.4 數據處理

所有實驗平行測定3次，數據表示為平均值±標準偏差，采用SPSS 20.0軟件ANOVA分析對數據進行方差分析，Microsoft Excel進行數據整理及計算，Peak View 2.0軟件對HPLC-TOF/MS2的數據進行鑒定分析，使用ChemDraw 16.0繪制結構圖。

2 結果與分析

2.1 漠河藍果忍冬的總酚、總花青素含量及比較分析

藍果忍冬果實中的多酚含量豐富，漠河市藍果忍冬果實中的總酚含量為(108.52±6.80) mg GAE/100g DW。WANG等[18]的研究發現野生藍果忍冬提取物的總酚含量是栽培品種總酚含量的1.7倍，YU等[19]也發現藍果忍冬的總酚含量11.8 mg/mL顯著高于紅穗醋栗10.33 mg/mL等其他漿果。漠河市藍果忍冬果實中的總花青素含量為(23.36±0.54)mg C3G/100g DW，分別約為白穗醋栗(0.15 mg C3G/100g DW)和蔓越莓(6.6 mg C3G/100g DW)的155.7和3.5倍[20]，這表明漠河藍果忍冬果實具有較高的利用價值，可作為獲取花青素的來源。

2.2 漠河藍果忍冬抗氧化活性的比較分析

漠河藍果忍冬果實清除DPPH自由基的能力為(201.19±9.97) μmol TE/g DW。瑞士栽培的7個藍果忍冬品種對DPPH自由基清除能力在60～228 μmol TE/g DW[21]，與本研究結果相近。漠河藍果忍冬果實的鐵離子還原力為(5.16±0.16) μmol TE/g DW。RUPASINGHE等[22]發現一些藍果忍冬品種對鐵還原能力明顯強于藍莓(16.24 μmol TE/g)、草莓(8.0 μmol TE/g)、黑莓(15.03 μmol TE/g)和覆盆子(7.57 μmol TE/g)。漠河藍果忍冬清除ABTS陽離子自由基自由基的能力為(658.18±9.73) μmol TE/g DW, 瑞士栽培的7個藍果忍冬品種對ABTS陽離子自由基自由基清除能力在125～485 μmol TE/g DW，其抗氧化能力顯著低于漠河藍果忍冬對ABTS陽離子自由基自由基清除的能力[21]。漠河藍果忍冬氧化自由基吸收能力法測得的抗氧化能力為(414.79±2.08) μmol TE/g DW，顯著高于一般漿果果實，如軟棗獼猴桃(28.37 μmol TE/g DW)、蔓越莓(13.50 μmol TE/g DW)等[20](圖1)。綜上所述，從漠河市藍果忍冬中提取的花色苷可有效清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基，對氧自由基表現出很好的吸收能力，并且對鐵離子還原能力較強，抗氧化能力強于大多數漿果，是抗氧化劑的較優來源。

圖1 漠河市藍果忍冬的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of blue honeysuckle fruits in Mohe city

2.3 漠河藍果忍冬抗脂肪酶活性的比較分析

人們攝取的膳食脂肪主要為甘油三酯，脂肪酶可水解甘油三酯隨后被人體吸收，對人類的肥胖癥，例如糖尿病等呈現明顯的相關性。而通過抑制脂肪酶，可降低人體吸收脂類物質的比例，達到治療人類肥胖癥的目的。漠河藍果忍冬果實的多酚提取液與脂肪酶聚合從而抑制脂肪酶的活性，抑制率高達53.2%，半抑制濃度(IC50)為1.912 mg/mL，這表明其對脂肪酶具有較強的抑制作用，高于覆盆子等果實提取物的抑制胃腸道脂肪酶活性的潛力[23]，通過減少脂肪消化來控制肥胖癥的有效治療靶點。因此它可以作為減肥類保健產品的天然來源，減少化學合成類減肥產品對人體帶來的不良副作用和耐藥反應，這也為研發安全性相對較高的減肥類產品帶來新的出路。

2.4 漠河藍果忍冬抗淀粉酶活性的比較分析

花色苷主要通過抑制碳水化合物水解酶(α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)降低糖尿病發生的概率。在本研究中，阿卡波糖作為陽性對照，對α-淀粉酶的IC50為140.2 μg/mL，漠河藍果忍冬果實對α-淀粉酶的抑制性如圖2所示，藍果忍冬果實對α-淀粉酶表現出抑制活性(IC50為6.399 mg/mL)。KITHMA等[24]測得在不同成熟階段下，4個品種的藍果忍冬果實提取物的抑制α-淀粉酶活性(IC50為2.38～5.08 mg/mL)，與本研究結果相近。MCDOUGALL等[23]發現多酚和花色苷是抑制α-淀粉酶活性的主要活性物質，這證實了藍果忍冬內因富含多酚而具有較強的抗α-淀粉酶活性，有效地抑制糖類降解酶的活性，表現出抗糖尿病的特性。

a-吸光度；b-α-淀粉酶的抑制率圖2 漠河市藍果忍冬對α-淀粉酶的抑制性Fig.2 Alpha-amylase inhibition activity of blue honeysuckle fruits in Mohe city

α-葡萄糖苷酶作為糖類水解過程中的關鍵酶，可以通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性從而降低血糖，可作為Ⅱ型糖尿病的降糖藥[24]。本研究中將阿卡波糖作為陽性對照，對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50為11.41 μg/mL。漠河藍果忍冬果實對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度為11.73 mg/mL，見圖3，與羅漢果皂甙粗提物對α-葡萄糖苷酶表現出的抑制活性(IC50為9.125 mg/mL)較接近[11]。研究表明藍果忍冬內含有的原花青素、咖啡酰奎寧酸等多酚類物質可能是抑制α-葡萄糖苷酶活性的重要原因[24]。

a-吸光度；b-α-葡萄糖苷酶抑制率圖3 漠河市藍果忍冬對α-葡萄糖苷酶的抑制性Fig.3 Alpha-glucosidase inhibition activity of blue honeysuckle fruits in Mohe city

2.5 漠河藍果忍冬果實多酚的鑒定

2.5.1 漠河藍果忍冬果實中花色苷的鑒定

花色苷單糖的糖苷在正離子模式下以陽離子形式存在，主離子峰為[M]+。花色苷二級質譜裂解方式為糖苷鍵斷裂或雙糖與糖苷苷源之間的糖苷鍵的斷裂，丟失單(雙)糖基團后產生對應的苷元碎片離子。根據表3的MS數據和保留時間，圖4的花色苷質譜圖以及文獻中的出峰時間和順序進行綜合分析[25-27]，可得出這些化合物：A1、A2、A3號峰均具有矢車菊素花色苷的離子為287m/z，其中A2號峰丟失1個葡萄糖基162m/z，推測為矢車菊素-3-葡萄糖苷；而A1號峰丟失3-位的1個葡萄糖基產生了離子碎片449m/z，接下來5-位的糖苷鍵斷裂丟失另外1個葡萄糖基，產生離子碎片287m/z，推測此為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷；A3號主離子峰為595m/z，3-位失去了1個蕓香苷雙糖糖基(308m/z)，產生碎片離子287m/z，所以推測為矢車菊素-3-蕓香糖苷；A4號分子離子峰為433m/z，3-為糖苷鍵斷裂產生天竺葵素離子碎片271m/z，因此推測A4號峰為天竺葵素-3-葡萄糖苷。

表3 漠河市藍果忍冬果實中花色苷鑒定結果Table 3 Identification of anthocyanins from blue honeysuckle fruits in Mohe city

圖4 漠河市藍果忍冬果實中花色苷質譜圖Fig.4 Mass spectrum of anthocyanins from blue honeysuckle fruits in Mohe city

根據上文花色苷單糖和雙糖糖苷的二級質譜斷裂特點，在A5和A6號峰中均具有芍藥素花色苷的離子為301m/z，因此可推測A5號峰為芍藥素-3-葡萄糖苷、A6號峰為芍藥素-3-蕓香糖苷；A7和A8號峰均具有矢車菊素花色苷的離子為611m/z，推測A7號峰為飛燕草素-3-葡萄糖苷、A8號峰為飛燕草素-3-蕓香糖苷。漠河市藍果忍冬果實中含4種類型的花色苷苷源：矢車菊素、芍藥素、飛燕草素和天竺葵素。其中矢車菊-3-葡萄糖苷為漠河藍果忍冬中相對最高的花色苷化合物，占總含量的92%。芍藥素-3-蕓香糖苷占總和的5%，而其他花色苷含量的總和僅占總花色苷含量的3%。漠河藍果忍冬果實中花色苷種類豐富，共檢測到8種花色苷，主要花色苷的結構式見圖5。

圖5 漠河市藍果忍冬果實中主要花色苷的結構式Fig.5 Structure of major anthocyanins from blue honeysuckle fruits in Mohe city

2.5.2 漠河藍果忍冬果實中非花色苷多酚的鑒定

漠河藍果忍冬中的非花色苷成分種類眾多，共24種,如圖6所示，主要非花色苷多酚的結構式見圖7。根據表4的MS數據和保留時間進行綜合分析，P1、P8和P19均具有奎寧酸的特征離子(m/z191)，因此被認定為奎寧酸及其衍生物。其中P8和P19在m/z353處顯示碎片離子，表示消除了咖啡酸部分。P19還存在二級質譜，根據文獻可判斷為二咖啡酰奎寧酸(裂解途徑見圖8-a)，是一類由奎寧酸與數目不等的咖啡酸通過酯化反應縮合而來。

表4 漠河市藍果忍冬果實中非花色苷多酚鑒定結果Table 4 Identification of non-anthocyanin polyphenols from blue honeysuckle fruits in Mohe city

圖6 漠河市藍果忍冬果實中非花色苷多酚質譜圖Fig.6 Mass spectrum of non-anthocyanin polyphenols from blue honeysuckle fruits in Mohe city

圖7 漠河市藍果忍冬果實中主要非花色苷多酚的結構式Fig.7 Structure of major non-anthocyanin polyphenols from blue honeysuckle fruits in Mohe city

P3和P5均具有檸檬酸的特征離子(m/z191),P4和P9均具有馬錢苷酸的特征離子(m/z375)。P2和P20號峰物質未知，根據文獻推測P2為奎寧酸類，P20為山奈酚類，MS數據的缺失可能是由于雜質的干擾引起的。P10和P14的碎片離子中均含有m/z289，根據CHEN等[28]的研究，在負離子模式下產生m/z289的碎片離子的化合物為上端為A-型結構的原花青素，因此P10為A型原花青素二聚體(裂解途徑見圖8-b)；P14與文獻報道[29]的譜圖一致，被確定為原花青素A2。P11、P13、P16、P18、P21、P22由二級質譜圖, 可知其分子離子峰m/z301，均具有槲皮素的特征離子。P12、P15、P24在二級質譜掃描顯示均有一個m/z285的碎片離子(山奈酚)，其中P12在碰撞中母離子失去了m/z308的蕓香糖苷(裂解途徑見圖8-c)，P15失去了m/z162的半乳糖苷。根據文獻[28]分析得出：P6、P7、P23為原金絲桃酸(m/z506)、龍膽酸(m/z153)和柚皮素(m/z272)。經鑒定得出：漠河藍果忍冬果實的非花色苷多酚中原花青素、山奈酚-3-蕓香糖苷和二咖啡酰奎寧酸的含量較高，即槲皮素、山奈酚等物質所占比重大。

a-二咖啡酰奎寧酸；b-原花青素二聚體；c-山奈酚-3-O-蕓香糖苷圖8 二咖啡酰奎寧酸、原花青素二聚體、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的裂解途徑Fig.8 Fragmentation pathway of dicaffeoyl-quinic acid, procyanidin dimer and kaempferol-3-O-rutinoside

3 結論

本研究結果顯示，漠河藍果忍冬果實中共檢測到8種花色苷，24種非花色苷多酚，其中富含矢車菊素-3-葡萄糖苷、原花青素、山奈酚-3-蕓香糖苷和二咖啡酰奎寧酸。藍果忍冬果實具有較高的總酚及總花青素含量，4種抗氧化分析方法結果表明，藍果忍冬均具有較強的抗氧化活性。抗酶分析結果表明，漠河藍果忍冬果實對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性具有較強的抑制作用，且可有效抑制脂肪酶。這可能與漠河藍果忍冬內含有高含量的多酚類物質有關，具有降低血糖的功效。該研究可為藍果忍冬產品的開發提供理論依據，對助推藍果忍冬功能性保健品、食品和藥品的研發具有重要意義。