鼠李糖乳桿菌MS1對副溶血弧菌群體感應淬滅作用的研究

上官文丹，陳松，韓翔鵬，劉丹，李堯，鐘青萍

(廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室,華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種嗜鹽性病原菌，廣泛分布于河口和海洋環(huán)境中，在魚、貝、蝦、蟹等海產(chǎn)品及腌漬食品中?？砂l(fā)現(xiàn)，能引起急性腸胃炎、敗血癥、傷口感染甚至死亡[1]。生物被膜是指細菌聚集黏附于生物或非生物表面后，通過生長繁殖及分泌胞外聚合物(DNA、蛋白質(zhì)和胞外多糖等)，將自身包裹在其中形成的具有復雜空間結構的成膜狀聚合體[2]。副溶血弧菌能以生物被膜形式存在，為菌體生長提供天然保護屏障，增強膜內(nèi)細菌抵抗外界不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導致持續(xù)性污染和感染[3]。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌是西班牙、美國、日本及世界多地導致海鮮相關腸胃炎的主要病因[4]；而在國內(nèi)，中國東海岸近些年共爆發(fā)與食源性致病菌相關的802病例中，約40.1%是由副溶血弧菌引起[5]。副溶血弧菌已成為威脅人類健康的主要食源性致病菌之一。

群體感應(quorum sensing，QS)是細菌之間借助信號分子進行通訊，使大量的細菌隨著種群密度和物種組成變化同步調(diào)控自身特定基因的表達，從而實現(xiàn)改變生物學行為的一種現(xiàn)象[6]。研究表明，副溶血弧菌形成生物被膜及表達毒力因子等生理過程受到QS系統(tǒng)的調(diào)控。蔣富鳳等[7]發(fā)現(xiàn)，受LuxM和LuxS基因調(diào)控的OpaR和AphA基因是副溶血弧菌QS系統(tǒng)級聯(lián)信號傳導機制中的2個核心調(diào)控子，與其運動性、生物被膜形成和毒力有關。李燦[8]和GUO等[9]均發(fā)現(xiàn)，在敲除調(diào)控副溶血弧菌合成QS信號分子的LuxM和LuxS基因后，其生長、溶血活性、tdh毒力基因表達以及生物被膜形成均受到不同程度影響。

QS抑制劑(QS inhibitors，QSIs)是具有QS淬滅作用的一類物質(zhì)，不同的QSIs通過不同的方式來干擾細菌QS過程，如抑制QS信號分子的生物合成，降解信號分子，與信號分子競爭結合受體位點，以及結合以清除信號分子等[10]。乳酸菌分布廣，種類多，屬于公認安全性(generally recognized as safe，GRAS)菌，目前已被廣泛應用于食品、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等領域中[11]。從乳酸菌中挖掘QSIs更不失為一種安全、高效的方式，目前乳酸菌源QSIs正引起學者們的關注，研究取得了一定的進展，如海洋源戊糖片球菌zy-B-1乙酸乙酯提取物能抑制單增李斯特的AI-2活性和生物被膜形成，具有良好的QSIs活性[12]。林洋等[13]從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中得到1株植物乳桿菌SCT-2，能通過QS抑制嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，并降低其蛋白酶和嗜鐵素的分泌量。本研究以副溶血弧菌QS系統(tǒng)為靶標，篩選出對其QS信號分子AI-2活性具有較強淬滅作用的鼠李糖乳桿菌MS1菌株，評價該菌株控制副溶血弧菌QS和生物被膜形成的效果，為開發(fā)一種綠色、安全、高效的乳酸菌源QSIs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

16株乳酸菌(包括菌株DF1、DF2、DF4、DF5、DF6、DF9、DF12、DF14、DF15、DF16、L14、L15、L17、GK3、CG2和MS1)均為本實驗室從發(fā)酵奶豆腐和發(fā)酵果汁中分離；哈維氏弧菌BB170和副溶血弧菌ATCC 17802，廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 30，pH 7.2。121 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏5，酵母粉4，葡萄糖20，磷酸氫二鉀1.52，乙酸鈉3.53，檸檬酸三銨2，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.038， 吐溫-80 1.0 mL，pH 6.0。121 ℃滅菌15 min。

AB培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鎂12.3，NaCl 17.5，酸水解酪蛋白(不含維生素)2，用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 7.5。121 ℃滅菌15 min后添加無菌的10 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀溶液(pH 7.5)及10 mL 0.1 mol/LL-精氨酸(pH 7.5)，20 mL 50%甘油。以上所用試劑均為市售的分析純或化學純試劑。

結晶紫，天津福晨公司；乙酸乙酯，天津富宇公司；PI染料、PBS緩沖液，上海生工公司；FITC-ConA染料，Sigma公司。

1.1.3 儀器與設備

PL602-S電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；YXQ-LS-50A全自動高壓滅菌鍋，上海博訊公司；150A生化培養(yǎng)箱，江蘇榮華公司；TS-200B恒溫搖床，上海天呈公司；5417R超高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；1285生物安全柜，美國Thermo公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；梯度PCR儀，日本Takara公司；R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)公司；光學顯微鏡，麥克Motic公司；EVO MA 15場發(fā)射掃描電鏡，美國FEI公司；LSM 7810 DUO and LSM 7 Live激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化

乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；副溶血弧菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h；哈維氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基中，30 ℃、90 r/min培養(yǎng)12 h。所有菌株均活化2代用于實驗。

1.2.2 乳酸菌乙酸乙酯提取物的制備

將活化的乳酸菌接于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾獲得乳酸菌發(fā)酵上清液。將上清液與乙酸乙酯等比例加入分液漏斗，振蕩萃取，靜置過夜。待分層后，收集乳化層，于37 ℃、120 r/min進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去乙酸乙酯。收集濃縮液，真空冷凍干燥成粉末(干燥器中保存)。實驗前將提取物溶于TSB或AB培養(yǎng)基，過濾除菌，配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL工作液，備用。

1.2.3 副溶血弧菌QSIs的篩選

采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法[14]測定經(jīng)過不同的乳酸菌源QSIs處理的副溶血弧菌的AI-2活性，以篩選乳酸菌源QSIs。將活化的副溶血弧菌接種于含2 mg/mL 乳酸菌源QSIs的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集、過濾獲得無菌上清液，備用。活化后的哈維氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、90 r/min培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌液OD595nm為0.8左右，再用無菌新鮮AB培養(yǎng)基按1∶5 000稀釋該菌液，混勻備用。按1∶50體積比將上述收集的上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。30 ℃、100 r/min搖瓶培養(yǎng)3 h，避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標板中，以多功能酶標儀檢測哈維氏弧菌BB170發(fā)光情況，以MS1-QSI未處理的副溶血弧菌為對照組。計算乳酸菌QSIs對副溶血弧菌AI-2活性的抑制率如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 MS1-QSI對副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長曲線的影響

采用全自動生長曲線儀進行測定。在100微型孔板孔內(nèi)分別加入200 μL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的TSB或AB培養(yǎng)基，以未含MS1-QSI的TSB或AB培養(yǎng)基為對照組。將活化的副溶血弧菌或哈維氏弧菌接種于孔內(nèi)。37 ℃或30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定OD600nm值。

1.2.5 MS1-QSI對副溶血弧菌群集和泳動的抑制

按照SANTHAKUMARI等[15]的方法進行并稍作修改。取2 μL上述1.2.5中培養(yǎng)前的含不同質(zhì)量濃度MS1-QSI的副溶血弧菌菌懸液接于群集平板(1%蛋白胨、3% NaCl、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖，pH 7.2)和泳動平板(1%胰蛋白胨、3% NaCl和0.3%瓊脂，pH 7.2)中央，以未加MS1-QSI作為空白對照組。37 ℃正置培養(yǎng)24 h，觀察2種培養(yǎng)基上副溶血弧菌遷移直徑的變化，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：dControl為空白對照組副溶血弧菌群集或泳動的遷移直徑，mm；dQSIs為MS1-QSI處理組副溶血弧菌群集或泳動的遷移直徑，mm。

1.2.6 MS1-QSI對副溶血弧菌AI-2信號分子活性影響

副溶血弧菌菌懸液加入含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基(菌的終濃度為107CFU/mL)，混勻，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后，離心、過濾收集上清液。按照1.2.3方法測定AI-2活性。

1.2.7 MS1-QSI對胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)生成的影響

按照NITHYA等[16]的方法進行。在48孔板孔內(nèi)加入1 mL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于孔內(nèi)(菌的終濃度為107CFU/mL)，每孔放入無菌蓋玻片，37 ℃溫育24 h。將培養(yǎng)后的蓋玻片放入含0.5 mL生理鹽水試管中，充分振蕩洗脫30 s后，加入0.5 mL 5%(體積分數(shù))苯酚，立即振勻并加入2.5 mL濃H2SO4，振蕩后測定OD490nm。抑制率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：ODControl指空白對照組測得的EPS的OD490nm值；ODQSIs指MS1-QSI處理后測得的EPS的OD490nm值。

1.2.8 MS1-QSI對生物被膜生物量的影響

采用結晶紫染色法測定生物被膜的生物量。在96板孔內(nèi)加入200 μL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于孔內(nèi)(菌的終濃度為107CFU/mL)，37 ℃培養(yǎng)24 h；移除孔內(nèi)浮游菌，用PBS緩沖液輕緩清洗2～3次，60 ℃干燥固定30 min；加入0.1%結晶紫染色5 min，用PBS緩沖液輕緩清洗3次，干燥；加入33%冰乙酸脫色10 min，測定OD595nm值。

1.2.9 光學顯微鏡觀察

在24孔板中分別加入1.5 mL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于培養(yǎng)基中(菌的終濃度為107CFU/mL)，每孔中放置無菌蓋玻片，37 ℃培養(yǎng)24 h。以未加入MS1-QSI處理的作為空白對照組；用超純水輕緩潤洗玻片，去除浮游狀態(tài)菌；以結晶紫染色5 min，棄染色液，用PBS緩沖液緩慢清洗玻片，室溫下晾干；用光學顯微鏡的油鏡觀察。

1.2.10 場發(fā)射掃描電鏡(field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM)觀察

將1.2.8獲得的生物被膜標本片，用PBS緩沖液輕緩潤洗3次，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定24 h；用PBS緩沖液輕緩清洗3次，加入1%鋨酸固定0.5 h；用PBS緩沖液輕緩清洗3次，用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%乙醇各脫水10 min，最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min；蓋玻片真空干燥后噴金，掃描電鏡下觀察生物被膜。

1.2.11 激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察

將1.2.8獲得的生物被膜標本片，用PBS緩沖液輕緩洗去玻片上的浮游菌，加入5 μL FITC Con-A染色液，4 ℃低溫染色30 min；加入5 μL PI染料，低溫染色15 min。上述染色和制片操作均在避光條件下進行。使用CLSM觀察，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為510 nm。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

實驗平行進行3次，取其平均值，結果采用Graphpad prism 7.0作圖，采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌源QSIs的篩選

圖1顯示，16株乳酸菌乙酸乙酯提取物對副溶血弧菌AI-2信號分子存在不同程度的抑制作用，抑制率為7.74%～69.54%；菌株DF1、DF4、DF5、L14、GK3、CG2、MS1對副溶血弧菌AI-2活性抑制率超過50%，可作為潛在的副溶血弧菌QSIs，其中鼠李糖乳桿菌MS1乙酸乙酯提取物抑制率達69.54%，將該提取物命名為MS1-QSI，進一步研究其對副溶血弧菌的抑制效果。

圖1 乳酸菌菌株的乙酸乙酯提取物對副溶血弧菌AI-2活性的影響Fig.1 Effects of the ethyl acetate extracts of different strains of lactic acid bacteria on AI-2 activity of V.parahaemolyticus注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 MS1-QSI對副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長的影響

圖2-A表明，隨著MS1-QSI濃度的增加，對副溶血弧菌生長的抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)劑量依賴性；圖2-B表明，MS1-QSI在添加質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對哈維氏弧菌的生長基本不產(chǎn)生影響。為證明菌株MS1是通過抑制副溶血弧菌QS而非抑菌發(fā)揮作用，后續(xù)實驗選擇0.8 mg/mL及以下質(zhì)量濃度的MS1-QSI進行。

A-副溶血弧菌；B-哈維氏弧菌圖2 MS1-QSI對副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長的影響Fig.2 Effect of MS1-QSI on the growths of V.parahaemolyticus and V.harveyi

2.3 MS1-QSI對副溶血弧菌群集和泳動能力的影響

群集和泳動是副溶血弧菌的主要運動方式，副溶血弧菌依賴鞭毛運動有利于增強生物被膜的形成，增加對海鮮食品的污染能力及對宿主的致病性[17]。由圖3可知，添加MS1-QSI后的致病菌運動范圍明顯縮小，且呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用。在群集平板中，對照組的群集直徑為(14.11±1.75) mm，添加0.8 mg/mL的MS1-QSI使細菌群集范圍縮小至(6.68±0.34) mm，抑制率達52.67%；在泳動平板中，對照組的遷移范圍靠近皿底邊緣，遷移直徑達(89.59±0.15) mm，表明副溶血弧菌的泳動能力強；添加0.8 mg/mL的MS1-QSI可使遷移直徑降低至(43.49±1.13) mm，抑制率達51.45%。

1～4-MS1-QSI添加質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.4、0.8 mg/mLA-副溶血弧菌群集；B-副溶血弧菌泳動圖3 MS1-QSI對副溶血弧菌群集和泳動的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of MS1-QSI on swarming and swimming of V.parahaemolyticu

2.4 MS1-QSI對副溶血弧菌群體感應AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的影響

AI-2型QS系統(tǒng)能調(diào)控副溶血弧菌生物被膜的形成。EPS是維持生物被膜復雜空間結構的主要基質(zhì)成分，能抵抗外界環(huán)境抗菌物質(zhì)的擴散，誘導并促進細菌耐藥性。圖4顯示，MS1-QSI對副溶血弧菌AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而顯著增加(P<0.05)。當質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 時，MS1-QSI對AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的抑制率分別達65.27%、65.54%、86.91%。結果表明，MS1-QSI可有效抑制副溶血弧菌的AI-2活性及EPS合成，從而抑制生物被膜形成。

圖4 MS1-QSI對副溶血弧菌AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的影響Fig.4 Effect of MS1-QSI on AI-2 activity, EPS synthesis and biofilm formation of V.parahaemolyticuss

2.5 光學顯微鏡和FESEM觀察生物被膜的變化

圖5為光學顯微鏡和FESEM觀察MS1-QSI對副溶血弧菌生物被膜的影響。在光學顯微鏡下，對照組中的副溶血弧菌菌落出現(xiàn)聚集，菌體間緊密聯(lián)結，處理組的細菌分布明顯稀疏。FESEM觀察發(fā)現(xiàn)對照組的副溶血弧菌聚集成團狀，形成具有明顯空間特征的生物被膜，而處理后的細菌則散落分布在視野中。結果表明MS1-QSI能有效阻止副溶血弧菌的相互聚集，抑制細菌聚集體的形成從而抑制生物被膜形成。

A-光學顯微鏡(1 000×)；B-FESEM(3 500×)圖5 光學顯微鏡和FESEM觀察MS1-QSI對副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.5 Observation of the biofilm of V.parahaemolyticus treated by MS1-QSI under light microscope and FESEM

2.6 CLSM觀察生物被膜的變化

熒光染料結合CLSM顯像技術可觀察生物被膜結構和厚度情況[18]。如圖6所示，對照組中的副溶血弧菌菌體連接致密，分泌大量EPS將自身包裹其中，生物被膜結構完整，具有一定厚度；處理組中的細菌疏散，生物被膜的熒光強度明顯減弱，表明細菌分泌的EPS顯著減少，生物被膜較對照組稀薄。

1～3-CLSM觀察下生物被膜的明場、平面及其熒光強度圖A-對照組；B-處理組圖6 CLSM觀察MS1-QSI對副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.6 Effect of MS1-QSI on the biofilm of V.parahaemolyticus

3 討論

AI-2型QS系統(tǒng)參與微生物的多種重要生化過程，是近年來研究的熱點，例如LuxS/ AI-2系統(tǒng)不僅介導銅綠假單胞菌的生長發(fā)育、生物被膜形成和致病性[19]，也可通過調(diào)節(jié)外排泵SatAB基因參與豬鏈球菌對氟喹諾酮類抗生素的敏感性[20]，還能調(diào)控肺炎球菌生物被膜與毒力等相關基因的表達[21]。以QS為靶標干擾細菌不引起細菌的耐藥性，對控制食品腐敗變質(zhì)和食物中毒，保障食品安全具有重要意義。目前，基于QS淬滅機制的微生物源QSIs研究取得了一定進展，但目標菌多集中于銅綠假單胞菌等致病菌，對副溶血弧菌的相關研究相對匱乏，本研究以副溶血弧菌QS系統(tǒng)為靶標，研究對其淬滅作用較強的乳酸菌，對控制副溶血弧菌的危害，以及拓寬乳酸菌的研究和應用領域，尋找新的食品防腐保鮮措施具有積極的意義。

本研究采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法篩選得到對副溶血弧菌群體感應AI-2活性抑制作用強的乳酸菌，并從細菌生長、運動、EPS產(chǎn)生以及生物被膜形成4個方面探究其對副溶血弧菌QS的淬滅作用。鞭毛運動不僅介導細菌在物體表面上的初始黏附，參與、維持生物被膜空間立體結構，也有利于細菌從成熟生物被膜中脫離并發(fā)生再黏附過程[2]。鞭毛突變體的單增李斯特菌顯著降低了在玻璃表面的黏附能力，形成有缺陷的生物被膜[22]；ENOS-BERLAG等[23]把副溶血弧菌鞭毛基因flgE和flgD敲除后，細菌的生物被膜形成能力減弱，不產(chǎn)生成熟生物被膜，說明鞭毛是生物被膜形成過程中的重要決定因子。MS1-QSI在不影響副溶血弧菌正常生長前提下，能有效阻止由副溶血弧菌鞭毛主導的群集和泳動現(xiàn)象，這與其他乳酸菌源QSIs能通過QS系統(tǒng)抑制嗜水氣單胞菌[24]、單增李斯特菌[12]的鞭毛運動結果相類似。EPS具有黏液性，能使細胞聚集并相互連接，從而在物體表面形成三維生物被膜結構[25]。GUVENER等[26]研究發(fā)現(xiàn)多糖合成基因(cpsA)受到群體感應調(diào)節(jié)因子OpaR的調(diào)控。本文研究表明MS1-QSI能顯著降低副溶血弧菌AI-2活性、干擾副溶血弧菌QS系統(tǒng)， 影響其鞭毛運動、EPS合成和生物被膜形成能力。鼠李糖乳桿菌MS1具有良好的QS淬滅活性，有望成為控制副溶血弧菌感染和致病性的新型生物制劑，其調(diào)控副溶血弧菌QS、生物被膜形成的分子機制還有待于進一步研究。