組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶在大腸桿菌中的重組表達及酶學性質研究

李金榮，辛瑜，石貴陽，顧正華，張梁

(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase，KDMs)主要分為兩類，其中組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1(histone lysine specific demethylase 1，Lsd1)是2004年第一個被鑒定出來的組蛋白脫甲基酶，是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶超家族成員之一[1]。Lsd1的脫甲基反應可被看作底物與黃素輔因子之間的氫化物轉移[2]，反應過程中同時涉及到與分子氧的反應[3-4]。另一類脫甲基酶則是含有Jumonji-C結構域的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(jumonji C,Jmjc)，于2006年首次被鑒定出來[5]，在Fe2+和O2的參與下直接氧化甲基，以脫甲醛的形式完成去甲基化[6-7]。

KDMs可以催化組蛋白H3K4[1, 8]、H3K9[9-10]的去甲基化反應。此外，KDMs具備豐富的底物特異性[11]，可以作用于多種非組蛋白底物，例如腫瘤抑制因子p53[12]、DNA甲基轉移酶1[13]。KDMs在多種腫瘤細胞中高表達，已經成為腫瘤治療藥物開發的重要靶蛋白，目前對于該酶的研究主要聚焦于多胺類抑制劑[14-15]以及可逆選擇性抑制劑[16]等。在該酶的研究過程中，也有利用大腸桿菌(Escherichiacoli)進行原核表達的，LAURENT等[17]在E.coliRosetta(DE3)-pET15b表達了人源的目的蛋白并進行了生化分析。

近年來，隨著食品行業的快速發展，相關的食品加工廢水的產生也在快速增長，主要含有氮、磷等化合物。關于食品工業廢水的處理已經成為相關領域的熱點問題，目前大多采用生物法、物理法和化學法等[18-20]，其中N—CH3類化合物很難實現降解，能夠對人體的神經系統以及肝腎造成嚴重損傷，同時對水生生物具有毒害作用。DASH等[21]從土壤中篩選出假單胞菌NCIM5235，能夠有效降解咖啡因，但是微生物降解底物單一，不能廣泛應用。

本研究選擇斑馬魚和咖啡來源的賴氨酸脫甲基酶進行研究，斑馬魚作為模式生物具有清晰的生物學背景，同時通過前期研究，植物中咖啡來源的脫甲基酶表現出與斑馬魚來源相似的底物特異性。本研究首先構建菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-lsD1和E.coliBL21(DE3)/pET28a-jmjC，然后表達純化獲得KDMs。通過發酵條件優化獲得體外可溶性KDMs，且首次對其進行酶學性質測定，為KDMs體外抑制劑的研發提供一定基礎，同時利用非組蛋白底物進行動力學研究，為后期催化含N—CH3類化合物降解的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株

大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、質粒載體pET28a均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑、培養基與儀器

LB培養基(g/L):酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃滅菌20 min。

試劑：TaqDNA聚合酶、質粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技公司；PrimerSTARMax DNA聚合酶、限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ，Takara公司；甲醛脫氫酶，SIGMA公司；α-KG、N-甲基-L-亮氨酸，上海麥克林生化科技公司；其他試劑均為國產分析純。

儀器：SCG蛋白純化系統，蘇州賽譜儀器有限公司；V-1200分光光度計，上海美普達儀器公司；S100D型PCR儀，美國BIO-RAD公司；Spark全自動酶標儀，TECAN公司；CF16RX-Ⅱ冷凍離心機，日本HITACHI公司；HYL-C組合式搖床，江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的構建

由NCBI數據庫中查找得到斑馬魚來源的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(Lsd1)的基因序列(GenBanK：NP_001229924.1)以及咖啡來源的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(Jmjc)的基因序列(GenBanK：XP_027103441.1)，并對兩種來源的序列進行大腸桿菌偏好性的密碼子優化，由蘇州金唯智生物科技公司合成。以合成的目的酶基因序列為模板設計引物,lsD1:P1(5′-CCGGAATTCATGCTGAGCAATAAGAAAAGCG-3′)、P2(5′-CCCAAGCTTTTATT-GGATACTTGGGCTCG-3′)，jmjC:P3(5′-CGAGCTCATGAGCATGATGAAACG-3′)、P4(5′-CCCAAGCT-TTTAACGACCGTCCTCAAC-3′)，進行PCR擴增。利用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和SacⅠ、Hind Ⅲ分別對基因片段lsD1和jmjC進行雙酶切，連接到質粒pET28a上，構建重組質粒pET28a-lsD1和pET28a-jmjC。,將兩個重組質粒以及空載質粒通過熱轉化法轉入到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)內，37 ℃、200 r/min后培養1 h，離心收集菌體，涂布至30 μg/mL卡那霉素的LB平板，在37 ℃培養箱中倒置培養12 h。從LB平板中隨機挑取轉化子進行菌落PCR驗證，將驗證正確的轉化子送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，最終獲得E.coliBL21(DE3)/pET28a-lsD1和E.coliBL21(DE3)/pET28a-jmjC重組菌株。

1.2.2 Lsd1和Jmjc的誘導表達

將2株重組菌BL21(DE3)/pET28a-lsD1和BL21(DE3)/pET28a-jmjC以及空質粒對照菌平板活化。活化菌株接入裝有15 mL LB培養基的50 mL錐形瓶中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養12 h，以此作為種子液，以1%的接種量轉至裝有50 mL LB培養基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃，200 r/min的條件下培養至OD600為0.6～0.8，分別加入終濃度為0.1、0.25 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，將添加2種不同濃度IPTG的培養基分別在37 ℃、200 r/min、7 h，25 ℃、200 r/min、12 h，16 ℃、200 r/min、24 h的條件下培養。4 ℃、12 000 r/min離心5 min收集菌體。用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(20 mmol/L、pH 8.0)洗滌并重懸菌體，用超聲儀破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.3 目的蛋白純化以及分析

利用鎳柱親和層析對目的蛋白Lsd1和Jmjc進行純化。先用A液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡蛋白系統，進樣。目的蛋白Lsd1在體積分數80% A液和體積分數20% B液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 8.0)條件下被洗脫收集，目的蛋白Jmjc在體積分數60% A液和體積分數40% B液條件下被洗脫收集，之后用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)透析去除高濃度的鹽，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，用SDS-PAGE分析檢測蛋白。

1.2.4 酶活力測定

2種KDMs組蛋白去甲基化酶反應的一個主要副產物都是甲醛，甲醛脫氫酶在輔酶煙酰胺腺嘌呤二苷酸(nacotinamide adenine dinucleotide,NAD+)存在的條件下，將NAD+還原為NADH，同時將甲醛氧化為甲酸。NADH通過酶標儀檢測并定量，激發波長為330 nm，發射波長為460 nm[22-23]，從而間接測定活性。反應總體積為400 μL，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)為整個反應的緩沖液，反應體系如下，Lsd1：10 mg/mL NAD+、0.01 U/μL甲醛脫氫酶、10 mmol/L底物、0.1 mg/mL純酶(保存于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH 7.0)；Jmjc：10 mg/mL NAD+、0.01 U/μL甲醛脫氫酶、10 mmol/L底物、0.1 mg/mL純酶(保存于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH 7.0)、l mmol/L Fe2+、1 mmol/L α-KG。

酶活力定義：在25 ℃，pH 7.0條件下，1 min內催化底物產生1 μmol 甲醛(HCHO)所需要的酶量，定義為1個酶活力單位(IU)。

1.2.5 酶學性質的研究

后續測定所用的酶液為鎳柱親和層析所收集的純酶液，測定中的底物均為N-甲基-L-亮氨酸。每個測定條件設置3個平行試驗。

(1)目的蛋白Lsd1和Jmjc的最適反應溫度和溫度穩定性的測定：在pH 7.0，溫度10～55 ℃條件下反應6 h，測定酶活力，以酶活力最高值為100%，確定最適反應溫度。將2個重組酶在10～70 ℃條件下保存30 min，然后在最適反應溫度、pH 7.0條件下反應6 h，測定酶活力，探究相關的溫度穩定性。

(2)目的蛋白Lsd1和Jmjc的最適反應pH和pH穩定性的測定：25 ℃條件下，分別在pH 4.0～10.0的緩沖液中反應6 h，測定酶活力，以酶活力最高值為100%，確定最適反應pH。25 ℃條件下，將2個目的蛋白在不同pH緩沖液中保存12 h，之后在最適pH，25 ℃條件下測定酶活力，確定pH穩定性。

(3)金屬離子對目的蛋白Lsd1和Jmjc的影響：在反應體系中添加Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+至終濃度分別為0.1、1.0、5.0 mmol/L，在最適反應條件下測定酶活力，以沒有添加金屬離子的酶活力為100%。

(4)動力學研究：選擇不同濃度N-甲基-L-亮氨酸，在最適溫度、最適pH條件下與純酶液反應6 h。根據米氏方程，使用雙倒數法計算Lsd1和Jmjc的Km值以及kcat/Km值。

2 結果與分析

2.1 組蛋白賴氨酸脫甲基酶基因在E.coli中的重組表達

2.1.1 組蛋白賴氨酸脫甲基酶基因的克隆

lsD1和jmjC基因的PCR擴增產物如圖1-a和圖1-b所示，在2 500、1 800 bp分別有1條單一的擴增片段，與目的片段lsD1(2 514 bp)和jmjC(1 728 bp)的大小一致。

2.1.2 重組菌構建

將PCR擴增的2個目的片段分別用限制性內切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和SacⅠ、Hind Ⅲ雙酶切，與相同酶切后的載體pET28a相連接，通過42 ℃熱擊轉化感受態E.coliBL21(DE3)細胞。菌落PCR驗證正確，并提取正確轉化子的質粒進行雙酶切驗證。結果如圖1-c和圖1-d所示，質粒pET28a-lsD1經EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 酶切后出現2個片段，與理論片段大小位置5 000、2 500 bp相符，經過測序驗證正確，表明重組菌株BL21(DE3)/pET28a-lsD1構建成功。重組菌株BL21(DE3)/pET28a-jmjC通過同樣方法驗證正確。

M-DNA markera- lsD1基因PCR擴增產物；b- jmjC基因PCR擴增產物；c-重組質粒PET28a-lsD1雙酶切驗證；d-重組質粒PET28a- jmjC雙酶切驗證圖1 lsD1和jmjC基因的PCR擴增產物及雙酶切驗證Fig.1 PCR amplification product of lsD1 and jmjC gene, double restriction digestion verification of recombinant vector PET28a-lsD1 and PET28a-jmjC

2.2 組蛋白賴氨酸脫甲基酶誘導表達、純化

發酵溫度過高或者誘導劑濃度過高在蛋白表達過程中會導致目的蛋白的快速、錯誤折疊，形成包涵體，無法或少量獲得可溶性目的蛋白。因此，本文對發酵溫度以及誘導劑濃度進行了優化。根據SDS-PAGE分析，在37 ℃條件下，目的蛋白主要以包涵體的形式存在，可溶性蛋白量過低，包涵體復性對于酶活力損失嚴重；16 ℃條件下，目的蛋白表達量過低；25 ℃條件下，獲得了大量的可溶性目的蛋白。為進一步減少包涵體的形成，進行了誘導劑濃度優化，0.10 mmol/L IPTG條件下形成的包涵體明顯少于0.25 mmol/L IPTG條件下。因此，本文選擇發酵溫度25 ℃，0.1 mmol/L IPTG，獲得了大量的可溶性目的蛋白。

為了得到高純度的目的蛋白，選用鎳柱親和層析。通過比較在目的蛋白N端、C端、N端和C端添加6×His標簽3種情況的蛋白親和力，最終選擇在目的蛋白C端添加標簽。Lsd1(110 kDa)在100 mmol/L咪唑的條件下被洗脫，Jmjc(65 kDa)在200 mmol/L咪唑的條件下被洗脫，結果如圖2所示。

M-蛋白markera-Lsd1純化產物；b-Jmjc純化產物圖2 重組菌BL21(DE3)/PET28a-lsD1和BL21(DE3)/PET28a-jmjC純化產物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified product of recombinant E.coli BL21(DE3)/pET28a-lsD1 and BL21(DE3)/PET28a-jmjC

2.3 重組組蛋白賴氨酸脫甲基酶酶學性質研究

2.3.1 最適反應溫度

將酶液分別放置在10、15、20、25、30、35、40、45、55 ℃下進行反應，測定酶活力，以最高酶活力為100%。結果如圖3-a所示，Jmjc最適反應溫度為20 ℃，Lsd1最適反應溫度為35 ℃。Jmjc在溫度較低時酶活力依然較高，在達到35 ℃時酶活力快速下降。Lsd1在溫度較低時酶活力較低，隨著溫度升高酶活力逐漸提高，但是在達到45 ℃時酶活力快速下降。

2.3.2 溫度穩定性

將酶液分別在10、20、30、40、50、60、70 ℃條件下保存30 min，然后分別在2個酶的最適反應溫度下測定剩余酶活力，以最高酶活力為100%。結果如圖3-b所示，2個酶在10～40 ℃下比較穩定，幾乎沒有酶活力損失，酶活力剩余90%以上，高于40 ℃時熱穩定性較差，酶活力快速下降，與Jmjc相比，Lsd1具有更好的熱穩定性。

2.3.3 最適pH值

2種酶分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，最適溫度條件下反應，以最高酶活力為100%。結果如圖3-c所示，Lsd1最適pH值為7.0，在酸性和堿性條件下，酶活力都大量損失，剩余酶活力20%左右。Jmjc最適pH值為8.0，在酸性條件下酶活力很低，pH 4.0～6.0時酶活力剩余30%以下，對于堿性有一定的偏好性，pH 10.0以上酶活力損失較大，與Lsd1相比，Jmjc的酸堿耐受力更強。

2.3.4 pH穩定性

將酶液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，25 ℃條件下保存12 h，并在各自最適溫度、最適pH條件下反應測定酶活力，以最高酶活力為100%。結果如圖3-d所示，Lsd1和Jmjc在pH 7.0、8.0、9.0剩余酶活力較高，在酸堿環境下耐受性比較差，所以2種酶適合在中性以及弱堿性環境下保存。

2.3.5 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子對Lsd1和Jmjc的作用效果各不相同，結果如圖3-e和圖3-f所示，Mn2+對Lsd1有明顯的促進作用，隨著濃度的升高Co2+也表現出一定的促進作用，而Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+表現出了明顯的抑制作用；同樣Mn2+對Jmjc起著明顯的促進作用，隨著濃度升高Co2+、Ca2+、Zn2+也較小幅度的提高了酶活力，但是隨著濃度的持續升高Co2+、Ca2+又表現出了抑制作用，而Mg2+、Ni2+則表現出明顯的抑制作用。

a-最適反應溫度；b-溫度穩定性；c-最適pH；d-pH穩定性；e-金屬離子對Lsd1的影響；f-金屬離子對Jmjc的影響圖3 溫度、pH、金屬離子對酶活力的影響Fig.3 The influence of temperature, pH and metal ions on enzyme activity

2.3.6 動力學研究

以N-甲基-L-亮氨酸為底物測定反應動力學特性，結果如圖4所示，測得Lsd1米氏方程為Y=1 321 480X+1 260 990，米氏常數Km為1.048 mmol/L，Vmax為7.9×10-7mmol/(L·min)，并計算得到kcat/Km分別為8.23×10-6L/(mol·s)；Jmjc米氏方程為Y=1 275 520X+829 909，米氏常數Km為1.537 mmol/L，Vmax為1.2×10-6mmol/(L·min)，并計算得到kcat/Km分別為1.06×10-5L/(mol·s)。可以看出2個酶對于底物的親和力較優，但是由于該類酶催化時間較長導致催化效率過低。通過兩者比較，Jmjc的催化能力相對優異。

圖4 Lsd1和Jmjc降解N-甲基-L-亮氨酸的動力學曲線Fig.4 Kinetic curve of N-methyl-L-leucine degradation by Lsd1 and Jmjc

3 結論與討論

本文進行了KDMs的原核表達以及酶學性質的研究。通過異源表達以及鎳柱親和層析成功獲得純化的KDMs，對該酶進行了酶學性質表征，結果顯示Lsd1、Jmjc的最適反應溫度分別為35、20 ℃，最適反應pH分別為7.0、8.0，Lsd1的溫度穩定性相對較高，Jmjc的酸堿耐受力更強；其中Mn2+對Lsd1和Jmjc的酶活力都有明顯的促進作用，Co2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+對兩者有不同程度的抑制作用；動力學研究發現，由于反應時間較長，Lsd1和Jmjc的催化效率較低，kcat/Km分別為8.23×10-6、1.06×10-5L/(mol·s)。

本研究首次利用非組蛋白底物對組蛋白賴氨酸脫甲基酶的酶學性質進行表征，且根據前期的探索確定，KDMs可以用于含N—CH3化合物的降解。根據報道發現，部分微生物可以直接降解該類化合物，例如假單胞菌GSC 1182[24]可以在48 h后降解80%的咖啡因，但是微生物降解底物單一且菌株種類少，因此具備廣譜底物的生物酶法更具優勢。與同樣可以降解該類物質的Hpo酶[25]相比，該酶的最適反應溫度與Jmjc相同為20 ℃，但是Hpo隨著溫度升高酶活力快速下降，30 ℃時酶活力就損失了20%，在應用方面有很大的局限性，而Lsd1和Jmjc在15～35 ℃酶活力差異較小，45 ℃時酶活力才損失20%，可以用于溫度相對較高的降解條件。同時Hpo酶[25]的最適反應pH為6.5，在pH值5.0～7.0，酶活性損失很小，但是堿性條件下酶活力大量損失，降解效率很低，而Lsd1和Jmjc在中性以及堿性的環境中酶活力損失很小，對于N—CH3污染物的中性以及堿性條件降解有很大的應用意義。

同樣，兩種酶的溫度穩定性明顯優于已報道的N—CH3降解酶HspB[26]，HspB在高于30 ℃時酶活力損失85%以上，而Lsd1和Jmjc在50 ℃時酶活力僅損失30%左右，溫度耐受性更好，應用范圍更寬泛。此外，與HspB酶[26]相比，2種酶的酸堿耐受性相對優勢，酶更加穩定。

但是與Hpo、HspB相比，KDMs的底物親和力較差，且反應時間較長，因為該酶在體內維持代謝途徑平衡對于高催化效率的需求較低，后期可以嘗試通過酶的定向改造，提高酶的反應速度以及進一步擴大底物譜， 更有效的降解化學方法難以解決的N—CH3污染物。