耐硒菌株Lysinibacillus fusiformis D1的鑒定及清除自由基能力研究

段玉樺，余雍和，楊銳，王一丹，周欣，王璋倩

1(武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢，430023)2(武漢輕工大學 硒科學與工程現代產業學院，湖北 武漢，430040) 3(武漢輕工大學，國家富硒農產品加工技術研發專業中心，湖北 武漢，430040)

硒是人和動物必需的微量元素，硒與人類和動物正常機體代謝和健康密切相關。微量的硒具有較強的生物活性，是很好的抗氧化劑[1]，有抗腫瘤[2]、防衰老和增強機體免疫力等多種功能[3]。人體不能合成硒，其攝入途徑主要是通過食用來自富硒土壤的作物。土壤環境中硒含量異常會引起人類的地方性疾病。硒在生物活性和毒性之間范圍非常狹窄，容易進入硒的毒性范圍[4]。20世紀60年代初在湖北恩施，發現人們食用了高硒土壤上生長的蔬菜后出現脫發,掉指甲,皮膚損壞等硒中毒癥狀[5]。

土壤硒污染會給當地的人和動物帶來重大傷害。采用傳統的土壤污染治理方法成本高、效果差，而近年來興起的生物修復技術是治理土壤硒污染的既有效又經濟的方法[6-7]。硒在土壤中按形態主要分為元素硒、硒化物、有機硒、亞硒酸鹽和硒酸鹽。土壤中無機硒的毒性要大于有機硒及納米硒。土壤硒污染生物修復可以借助微生物自身作用分解土壤中的有毒無機硒，轉化得到的納米硒比無機硒或有機硒更能被生物有效利用，近年來使用納米硒處理的植物有銀杏[8]、小麥和水稻[9]等，使用生物納米硒處理銀杏幼苗，銀杏葉葉綠素、可溶性糖和總黃酮醇苷含量大幅提高，產量和品質均有提升[8]，現階段耐硒菌株耐受能力普遍在0～20 mg/mL[10-11]，因此篩選高耐硒并能轉化無機硒為生物納米硒的微生物具有廣闊前景。

近年來，環境持久性自由基(environmental persistent free radicals, EPFRs)因具有環境毒性而受到廣泛關注，EPFRs的潛在危害主要歸因于其在環境中誘導產生活性的次生自由基如羥自由基等，可攻擊細胞膜、脂質蛋白、DNA等，造成氧化損傷。LIAO等[12]研究表明持久性自由基具有抑制多種作物發芽率、質膜損傷等現象。因此在處理土壤污染的時候要充分考慮到存在EPFRs，對EPFRs的清除可以通過清除過程中的次生自由基中間體的方法，研究土壤中微生物是否具有清除自由基能力，對修復環境、人類健康具有重要的意義。因此本文也對篩選得到耐硒菌株所制備的納米硒(nano-Se，SeNPs)以及次生代謝產物在體外清除自由基能力進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2020年9月在江漢平原富硒帶(湖北武漢東西湖區)采集土壤深度10 cm以下的土樣。

1.2 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，OXIOD；瓊脂粉，Biosharp；亞硒酸鈉，Sigma；DPPH，Phygene；ABTS底物，BOSF；水楊酸，SCR；FeSO4，天津永晟精細化工。

1.3 儀器與設備

FA-45-12-17Eppendorf 離心機，德國艾本德公司；BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌器，上海博迅實業有限公司；725G紫外可見分光光度計，Biobase。

1.4 耐硒菌株分離與篩選

1.4.1 菌株分離

將采集土樣顆粒均勻分散到LB固體培養基上，37 ℃培養。次日將單菌落轉接。

1.4.2 耐硒能力篩選

1.4.2.1 初篩

從上述分離的單菌落分別接種到含9、17、26、35、43、52 mg/mL亞硒酸鈉的LB平板中。根據平板是否出現微紅至深紅色菌落，挑選能產生深紅色菌落的菌株進行復篩。

1.4.2.2 復篩

將初篩后的不同菌株種子液分別接種于含9、17、26、35、43、52 mg/mL亞硒酸鈉的LB液體培養基中。37 ℃恒溫振蕩培養，觀察液體顏色是否轉變為微紅至深紅色，挑選能轉變為深紅色時亞硒酸鈉濃度最高的菌株。

1.5 耐硒菌株D1鑒定

1.5.1 D1菌株形態學鑒定

將D1接種到LB平板上，37 ℃培養24 h后觀察并記錄菌落形態；進行革蘭氏染色，在×100進行顯微觀察菌體形態。

1.5.2 D1菌株生理生化鑒定

生理生化實驗分別從細菌的氧化酶實驗、V-P實驗、吲哚實驗、明膠液化實驗、碳源利用情況等幾個方面進行。該實驗參考《常用細菌系統鑒定手冊》[13]。

1.5.3 D1菌株16S rRNA序列測定和系統發育樹構建

提取D1菌株的DNA送至上海生工生物工程股份有限公司進行16S rRNA序列測定。將測序所得序列通過BLAST軟件在GenBank基因庫中進行同源性比較，應用Clustal X和MEGA軟件進行多重比較后構建系統發育樹。

1.6 D1菌株生長動力學實驗

菌株D1種子液按1%的接種量分別接種于含0、9、17、26 mg/mL亞硒酸鈉的LB液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養。每隔2 h進行取樣。將上述取出的菌液，以滅菌水作為對照，測定OD600nm值，繪制生長曲線。

1.7 SeNPs及次生代謝產物的制備

1.7.1 納米硒純化

將活化好的D1菌株接種于含9 mg/mL亞硒酸鈉的LB培養基中，連續搖培48 h。收集紅色菌液，9 000 r/min，離心20 min，收集沉淀。沉淀用液氮研磨，超聲，將紅色懸液分別過20、10、5、3、1.2、0.8 μm的濾膜，將過濾后紅色懸液用正己烷充分萃取，收集下層，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀即為產品，烘干稱重[14]。

1.7.2 菌株次生代謝產物的收集

將D1菌株接種于LB培養基中，連續搖培48 h。將上述培養液8 000 r/min離心10 min，收集上清液。用等體積的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層并干燥稱重。

1.8 D1菌株制備的納米硒表征

將分離純化的納米硒通過動態光散射法(dynamic light scattering，DLS)對粒徑進行測定。

1.9 D1菌株的清除自由基能力測定

1.9.1 供試品的制備

取適量純化后的納米硒，超純水溶解，配制為10 mg/mL的樣品母液。取適量D1菌株的乙酸乙酯萃取物，無水乙醇溶解，配制為10 mg/mL的樣品母液。并將樣品母液逐級稀釋成質量濃度為15、30、75、150、745、1 045 μg/mL的樣品溶液備用。

1.9.2 DPPH自由基清除率的測定

參考都鵬程等[15]的方法稍作修改。利用無水乙醇配制濃度為0.25 mmol/L的DPPH溶液。吸取DPPH溶液600 μL，加入不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，于暗處反應30 min，測定OD517nm值，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：DC，DPPH自由基清除率，%；As，樣品與DPPH溶液混合后的吸光值；Ac，樣品與無水乙醇混合后的吸光值；Ab，DPPH溶液與水混合后的吸光值。

1.9.3 ABTS陽離子自由基清除率的測定

配制7.4 mol/L ABTS溶液以及2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，等比混合，室溫避光反應12 h，用無水乙醇溶液稀釋至OD734nm值為0.75，即為ABTS工作液。吸取ABTS工作液600 μL，加入不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，于37 ℃恒溫反應30 min，測定OD734nm值，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：DC，ABTS陽離子自由基清除率，%；As，樣品與ABTS工作液混合后的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，ABTS工作液與水混合后的吸光值。

1.9.4 羥自由基清除率的測定

參考范三紅等[16]方法稍作修改，在試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液200 μL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液200 μL，不同濃度的納米硒及次生代謝物樣品溶液70 μL，再加入30%(體積分數)的H2O2溶液200 μL，靜置30 min，測定OD510nm值，計算如公式(3)所示：

(3)

式中：DC，羥自由基清除率，%；As，樣品與羥自由基的反應體系混合后的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，羥自由基的反應體系與水混合后的吸光值。

2 結果與分析

2.1 耐硒菌株分離與篩選

2.1.1 菌株分離

從江漢平原富硒帶土壤樣品中共分離到具有不同菌落特征的微生物菌株85株。

2.1.2 耐硒能力篩選

2.1.2.1 初篩

經過加硒濃度遞增篩選，能夠在硒質量濃度43 mg/mL的LB固體培養基上生長較好的菌株有6株，分別命名為D1、R16、D131、ESW18、ESD9、ESD14。這些菌株均能將亞硒酸鈉還原成紅色單質硒，在含硒平板上呈現紅色菌落(圖1)。

圖1 D1菌株在含硒平板紅色菌落形態Fig.1 Red-colored colonies of the D1 on agar plates that containing Na2SeO3

2.1.2.2 復篩

將初篩后的菌株活化后經耐硒液體濃度梯度篩選，比較菌株在富硒培養液中產生的顏色變化，如表1所示，篩選1株耐硒能力最強的菌株，該菌株編號為D1。該菌株對亞硒酸鈉的耐受范圍為0～35 mg/mL。

表1 不同菌株在含硒LB液體培養基中的顏色變化Table 1 Color changes of different strains in LB broth containing selenite

2.2 耐硒菌株D1鑒定

2.2.1 D1菌株形態學鑒定

D1菌株菌落形態如圖2-a所示。菌株D1生長良好，菌落為圓形，中間有凸起，邊緣不光滑，黏稠不透明，白色。菌株D1革蘭氏染色后鏡檢結果如圖2-b所示，其細胞呈桿狀，兩端橢圓形,芽胞端生，卵圓形。

a-菌落形態；b-革蘭氏染色圖2 D1菌株菌落形態及革蘭氏染色Fig.2 Colony morphology and gram staining of the Dl

2.2.2 菌株生理生化鑒定

由表2可知，菌株D1的已測特征與Lysinibacillusfusiformis菌株的主要特征基本一致，可從其形態特征和生理生化特征初步判斷該菌屬于Lysinibacillus屬。

表2 D1菌株與紡錘形賴氨酸芽孢桿菌生理生化特性比較Table 2 Differential characteristics of strain D1 and Lysinibacillus fusiformis

2.2.3 D1菌株16S rRNA序列測定和系統發育樹構建

2.2.3.1 16S rRNA序列測定

L．fusiformisNBRC 15717是D1菌株16S rDNA序列在GenBank上Blastn同源性為99%的1株菌株。

2.2.3.2 系統發育樹構建

結果如圖3所示，D1菌株與各種Lysinibacillus屬菌株的遺傳距離很小，且D1與L．fusiformisNBRC 15717在同1個分支中。

圖3 菌株D1 16S rRNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the D1 based on 16S rRNA sequences

2.3 D1菌株生長動力學實驗

D1菌株在不同亞硒酸鈉濃度條件下的生長曲線(圖4)顯示，D1菌株生長在4 h進入指數期，約28 h進入穩定生長期。亞硒酸鈉濃度的增加對細菌的生長的抑制作用也逐漸增強，亞硒酸鈉濃度變大導致菌株生長的滯后階段持續時間增加。

圖4 菌株D1在含不同濃度亞硒酸鈉培養基中的生長曲線Fig.4 The growth curve of D1 in culture medium with different concentrations of sodium selenite

2.4 D1菌株制備納米硒表征

DLS分析表明紅色產物為納米單質硒，粒徑為(306.20±1.64) nm(圖5)。

圖5 菌株D1制備SeNPs粒徑大小Fig.5 Preparation of SeNPs Particle size by Lysinibacillus fusiformis Dl

2.5 D1菌株的自由基清除能力測定

2.5.1 DPPH自由基清除率的測定

如圖6所示，D1次生代謝產物(圖6-b)具有一定的DPPH自由基清除能力，其質量濃度為1 045 μg/mL時，DPPH自由基清除率達(66.38±0.67)%，且次生代謝產物呈現明顯的劑量依賴性。D1菌株制備的SeNPs(圖6-a)和亞硒酸鈉(圖6-c)均具有較弱的DPPH自由基清除能力。

a-納米硒；b-次生代謝產物；c-亞硒酸鈉圖6 DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging ability注：ns表示無顯著性差異(P>0.1)；**表示差異顯著(P<0.05)；同一行不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

如圖7所示，D1次生代謝產物(圖7-b)和亞硒酸鈉(圖7-c)均具有較強的ABTS陽離子自由基清除能力。次生代謝產物質量濃度為150 μg/mL時，ABTS陽離子自由基清除率達(99.94±0.08)%。D1菌株制備的SeNPs(圖7-a)具有一定的ABTS陽離子自由基清除能力，在1 045 μg/mL的質量濃度下，ABTS陽離子自由基清除率為(59.81±5.09)%。該3個樣品自由基清除能力均隨樣品溶液濃度增大而增強。

a-納米硒；b-次生代謝產物；c-亞硒酸鈉圖7 陽離子自由基清除能力Fig.7 ABTS radical scavenging ability

2.5.3 羥自由基清除率的測定

如圖8所示，D1菌株的次生代謝產物(圖8-b)和亞硒酸鈉(圖8-c)具有一定的羥自由基清除能力。次生代謝產物在質量濃度為745 μg/mL時，羥自由基清除率達(36.16±0.16)%。D1菌株制備的SeNPs(圖8-a)具有較弱的羥自由基清除能力。自由基清除能力均隨這3個供試品溶液濃度增大而增大。

a-納米硒；b-次生代謝產物；c-亞硒酸鈉圖8 羥自由基清除能力Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging ability注：*表示差異顯著(0.05

3 結論與討論

本研究從江漢平原土壤中分離得到了1株高耐硒菌株D1，鑒定為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)。已見報道的L.fusiformis主要分離自土壤，污染水體[17]，它們在環境中具有降解石油[18]、還原鉻和降解纖維素[19]等功能，但其關于耐硒能力的報道較少。D1對35 mg/mL高質量濃度亞硒酸鹽有一定的耐受性。該菌株制備的Se0粒徑大小為306.20 nm。研究表明D1能夠將高濃度亞硒酸鈉轉化為高安全性的納米硒，對硒污染地域的微生物修復具有重要的意義，而且轉化產物生物納米硒可以更好地促進土壤中植物的生長發育[8]。D1的次生代謝產物對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除能力較強，D1菌株制備的納米硒具有一定的ABTS陽離子自由基和羥自由基清除能力，較次生代謝產物活性較弱，這可能是因為納米硒粒徑大小對清除自由基能力有一定的影響[20]。有待進一步探究該菌株后續分離純化及活性物質，為菌株的綜合利用以及研究清除持久性自由基能力奠定基礎。