高速逆流色譜法分離純化麥芽糖基-β-環糊精

吳雪，邱超，王金鵬

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214000)

分支環糊精是在酶的作用下，通過α-1,6糖苷鍵將單糖或二糖結合到環糊精C-6位的羥基上形成的環糊精衍生物。麥芽糖基-β-環糊精(maltosyl-β-cyclodextrin，M-β-CD)的制備是以麥芽糖和β-環糊精(β-cyclodextrin，β-CD)作為底物，在高底物濃度下通過普魯蘭酶逆向合成[1]，或以麥芽糖基氟化物和環糊精作為底物，在解支酶糖基轉移作用下制備的一類分支環糊精[2]。與β-CD相比，M-β-CD具有更低的溶血活性[3]、更高的水溶性和更優的包埋性能以及靶向作用[4]等優點，在食品、醫藥、精細化工等領域應用日益廣泛。經過前人研究，M-β-CD在底物應用、生產工藝、菌種選擇等方面不斷優化，合成體系中產物轉化率已提高至50%以上[5]，但是仍然不能規模化生產，其原因是分離成本過高。為保證反應逆向進行，底物的濃度高達83.3%，其中麥芽糖含量約為74.9%，M-β-CD含量僅占10.5%，高濃度的麥芽糖導致反應體系呈高黏稠狀態，大大增加了分離成本與難度，并且由實驗室前期實驗可知，高濃度麥芽糖的存在也會影響M-β-CD的分離，分離成為M-β-CD工業化的瓶頸。

為了高效地從合成體系中分離目標產物，研究者嘗試了各種分離方法，如膜過濾、凝膠層析、色譜法等。其中，色譜法因精度高、分辨率好、獲得產物純度高，被認為是最適用于M-β-CD分離的技術。如IWAHORI等[6]采用反相高效液相色譜法分離了M-β-CD，但上樣量不足1 mg；JINGRICH等[7]用紙層析和高效液相色譜分離麥芽糖基-α-環糊精酶制液中的產物；WATANABE等[8]利用色譜柱分離了單半乳糖基-α-環糊精和二半乳糖基-α-環糊精。上述的分離方法分離分支環糊精，需要用到大量有機溶劑作為洗脫劑，這不僅造成工藝復雜，而且大大增加生產成本，無法規模化生產。因此亟需對M-β-CD分離方法進行改進。

高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種連續高效的液-液分配色譜分離技術，結合了液液萃取和分配色譜的特點，無需任何固態載體或支撐，流動相和固定相選擇更加多樣，組合更加靈活，同時具有單次進樣量大，樣品不需精制的優勢。HSCCC在實驗室級別高純度天然產物制備方面得到了很多應用[9-11]，但目前尚未有HSCCC分離M-β-CD的報道，因此有必要對此做研究。目前HSCCC對天然產物研究集中在中性化合物研究上，而對于糖類這類高極性物質分離研究較少。糖類由于高度親水，難以找到合適的溶劑體系應用于糖類的分離，因此起步較晚。有關HSCCC分離糖類的溶劑體系，目前存在：(1)傳統有機試劑兩相體系：溶劑體系極性不高，分離效率不大，且大量使用有機試劑[12-13]；(2)雙水相體系：極性很強，綠色環保，但是容易受溫度影響，體系不穩定，且在色譜中固定相保留率低[14]；(3)醇鹽溶劑體系：極性強，利于糖類分配，所使用溶劑可回收再利用。SHINOMIYA等[15]初次使用乙醇-硫酸銨(2 mol/L)(體積比3∶5)兩相系統改進了CCC中糖的早期分離，WARD等[16]在此基礎上加入二甲亞砜作為糖類分離改性劑，用乙醇-二甲基亞砜-硫酸銨(300 g/L)(體積比0.8∶0.1∶1.8)兩相體系成功分離得到純度大于90%的鼠李糖、阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸。因此，研究合適的HSCCC溶劑體系，可讓HSCCC成為經濟高效分離純化M-β-CD的方法。

實驗室前期已采用膜分離對M-β-CD進行了初步分離，但由于酶合成體系中麥芽糖含量過高，僅通過膜分離技術難以分離純化。本研究利用HSCCC技術進一步對膜分離后的M-β-CD進行分離純化。通過篩選和優化HSCCC溶劑體系組成，建立了一套M-β-CD的HSCCC分離純化方法。該方法操作簡單，耗時短，提高了M-β-CD分離效率與純度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

乙醇、二甲基亞砜、丙酮、四氫呋喃、石油醚、異丙醇、氨水、硫酸銨、磷酸氫二鉀、β-環糊精均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；普魯蘭酶、麥芽糖(純度>95%)，上海源葉生物有限公司；乙腈(色譜級)，上海阿拉丁有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

TBE-30A高速逆流色譜儀，上海同田生物技術有限公司；高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；LC-20T高效液相色譜，日本島津公司；色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Waters公司；電子天平(分度值=0.000 1 g)，奧豪斯科技有限公司；移液器(1 000 μL)，德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 M-β-CD膜分離樣品的制備

稱取200 g麥芽糖和40 g β-CD到97 mL pH 5.0 的醋酸緩沖液中，加入普魯蘭酶(300 U/g β-CD)，60 ℃ 下恒溫下于振蕩水浴鍋內反應60 h后高溫滅酶，然后稀釋4倍，抽濾去除固體顆粒和沉淀的酶，接下來通過截留值為5 kDa的卷式膜進行超濾去除殘留的酶蛋白，最后使用截留值為1 kDa卷式膜通過間歇滲濾實現麥芽糖的去除。設置滲濾條件為0.4 MPa、40 ℃，物料質量濃度為100 g/L，間歇循環4次后得到的濃縮液，經噴霧干燥后待用。

1.2.2 高速逆流色譜溶劑體系相圖制作

相圖的繪制采用濁點滴定法[17]。用乙醇緩慢滴定已知濃度的無機鹽溶液，并在混合器上混合，觀察溶液澄清程度，直到溶液開始出現渾濁為止(雙相區)。然后逐滴加入去離子水，直到出現澄清的單相溶液，再繼續滴加乙醇。如此反復，記錄好每次滴加的乙醇體積以及水的體積，計算每次達到渾濁時乙醇及無機鹽在系統總量中的百分含量。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑體系的篩選

本實驗借鑒常見的低聚糖的HSCCC分離體系，結合M-β-CD的極性，選取乙醇-鹽-水體系，為了防止添加有機相后發生鹽沉淀，因此在將有機溶劑添加到體系之前，先根據所選溶劑系統中的比例將無機鹽溶液與水充分混合，隨后測定不同溶劑體系下的分配系數。測定方法如下：分別稱取10 mg的麥芽糖、β-CD、M-β-CD，置于10 mL試管中，加入平衡后的上、下相各2 mL，振蕩使其完全溶解，靜置分層，分別取上、下相進行HPLC分析，上相和下相峰面積比值即是分配系數[18]，分配系數之間的比值即是分離因子α。所有實驗重復3次。

1.2.4 M-β-CD的高速逆流色譜分離純化

將固定相(上相)以20 mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相(上相)充滿螺旋管后，開啟高速逆流色譜儀，調整轉速為950 r/min，同時流動相(下相)以1.5 mL/min的流速泵入充滿固定相后的螺旋管中，待末端有流動相流出時，即螺旋管中上下相已達到動態平衡。將1.2.1中制備的樣品溶液從進樣閥中注入高速逆流色譜儀，每隔5 min收集餾分。HPLC檢測分析各餾分并采用面積歸一化法計算純度。

1.2.5 HPLC分析條件

色譜條件：X Amide色譜柱(2.1 mm×75 mm，2.5 μm)；流動相：65%(體積分數)乙腈-1%(體積分數)氨水；檢測器：RID-10A；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 不同鹽離子的雙水相圖繪制

HSCCC中用于分離高極性化合物最常用的溶劑體系是正丁醇-水，加入少量甲醇或乙酸作為改性劑[19]。但是由于正丁醇具有高黏度特性，因此這種溶劑體系固定相保留率低，導致分離效果差。而根據鹽析萃取理論，添加無機鹽可顯著降低高親水性化合物在水溶液中的溶解度，有利于極性化合物在有機相中的分配[20]，因此，醇鹽體系或可優化高極性糖類化合物在HSCCC的分離純化。在此選擇磷酸氫二鉀、硫酸銨、磷酸二氫鈉與乙醇組成兩相體系，探究其與乙醇成相能力，并選擇實驗中合適的鹽濃度。

由圖1可知，磷酸氫二鉀與乙醇成相能力最好，即在低濃度乙醇下也可成相。在雙水相形成過程中，鹽和水分子的相互作用起著非常重要的作用。離子所帶的電荷越多、離子半徑越小，則越容易形成雙水相，例如，陽離子鹽析效應為Al3+>Fe3+>Mg2+>Ca2+>Li+>Na+>NH4+>K+。而在實驗過程中又發現，乙醇濃度越高，上下相體積比越小，體積比過小將不利于目標物分配且會造成浪費，因此為合理分配上下相體積，同時在兩相形成體積范圍內，選取硫酸銨質量濃度為250、300、350 g/L，磷酸二氫鈉與磷酸氫二鉀均為300、400、500 g/L。

圖1 不同鹽離子與乙醇的雙曲線相圖Fig.1 Binodal curves for the different salt with ethanol ATPS

2.2 鹽離子及其濃度篩選

鹽的種類和濃度對分配系數的影響主要反映在對相間電位和疏水性的影響。依據2.1中篩選的鹽離子濃度范圍，考察其成相時間及測定所形成的不同溶劑體系對麥芽糖、β-CD、M-β-CD分配系數的影響，結果如表1所示。

表1 不同類型及不同濃度鹽離子對環糊精及麥芽糖分配系數的影響Table 1 Effects of different types and different concentrations of salt ions on the partition coefficient of cyclodextrin and maltose

由表1可知，在3種鹽與乙醇形成的兩相體系中，3種糖的分配系數各不相同，但都遵循著相同的規律：鹽的質量濃度越高，分配系數越大，鹽所占體積比例越大，分配系數越大。這可能是隨著下相中鹽的質量濃度增加，鹽析能力增強[21]，競爭水分子能力增強，吸引上相中的水分子逐漸轉移至下層鹽相，而有機溶劑逐漸從鹽相轉移至有機相，因此分配系數逐漸增大[22]。其中磷酸氫二鉀中分配系數最大，遠遠超過逆流色譜合適分配系數范圍(K=0.5～2)[18]，不適合用于分支環糊精的HSCCC分離。低濃度的硫酸銨分配系數尚在合理范圍內，但均大于磷酸二氫鈉中的分配系數。這可能是由于硫酸銨的酸性小于磷酸二氫鈉，而環糊精易溶于堿性溶液，因此吸引更多環糊精溶于下相，使得分配系數變大。另外由于β-CD親水性弱，在水中的溶解度遠遠不及麥芽糖和M-β-CD，因此分配系數始終最小。而M-β-CD接枝一個麥芽糖單位，既又有環糊精內親水外疏水性質，又具有麥芽糖的親水性，因此在磷酸二氫鈉溶液中，分配系數小于麥芽糖。

在硫酸銨鹽體系中，M-β-CD與麥芽糖分離系數相差不大，α<1.5，這會使得這2種物質分離不完全，影響分離純度，因此也不適合環糊精體系的分離。而磷酸二氫鈉體系的分層時間較長，會造成出峰時間慢、峰圖變寬、固定相保留率低等問題，將影響逆流色譜最終分離效果，因此接下來需要進一步改性磷酸二氫鈉體系以縮短分層時間。

2.3 改性劑選擇及其比例

選擇極性稍小的有機試劑加入兩相體系中，擴大上下相極性的差異，可縮短分層時間?？紤]到環糊精溶解度以及溶液自身極性等因素，選擇乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃、石油醚等5種有機試劑作為改性劑添加在兩相體系中，測定麥芽糖、β-CD、M-β-CD在新兩相體系中的分配行為(表2)。

表2 不同改性劑對分層時間及分層體積比的影響Table 2 The influence of different modifiers on settling time and volume ratio

由表2可以看出，在加入改性劑后，上下相極性差距變大，兩相體系分層時間明顯縮短，皆在30 s附近，符合逆流色譜對分層時間的要求，但石油醚加入后兩相體系分成三相，不適合此體系。

如表3所示，加入改性劑后，對上相有機相極性有所改變，因此3種糖的分配系數也隨之變化，均隨著上相極性的減小而增大，但變化幅度不同。四氫呋喃體系中未在上相中檢測出3種糖，因此不適合用作改性劑，而乙腈與異丙醇的加入使得麥芽糖與M-β-CD分配系數增大至3以上，且兩者之間分離因子差距變小，因此也不適合用作改性劑。丙酮在縮短分層時間的同時保持3種糖的分配系數依然在合適范圍內，并未有較大影響，作為改性劑較為合適。

表3 不同改性劑對麥芽糖、β-環糊精、麥芽糖基β-環糊精分配系數的影響Table 3 Effect of modifiers on the partition coefficient of maltose, β-CD and M-β-CD

進一步探究丙酮作為改性劑的濃度對分配系數的影響，由于麥芽糖與M-β-CD分配系數較為相近，因此只需考慮麥芽糖與M-β-CD分配系數即可，尋找合適的體積比使兩者差異更大。根據表1磷酸二氫鈉的分層時間以及分配系數的結果，選擇300 g/L以及350 g/L 2種鹽濃度，醇鹽體積比2∶3為基礎進行研究。表4結果表明，當磷酸二氫鈉質量濃度為300 g/L，磷酸二氫鈉-乙醇-丙酮體積比為6∶2∶1.5時，麥芽糖分配系數為1.78, M-β-CD為1.04，兩者α達到最大值1.72，通常情況下，α>1.5代表兩者物質可在高速逆流色譜儀器分開[23]。因此選擇此體系當做逆流色譜兩相溶劑體系。

表4 丙酮濃度對麥芽糖和麥芽糖基β-環糊精分配系數的影響Table 4 Effect of acetone concentration on the partition coefficient of maltose and M-β-CD

2.4 分離效果

將膜分離后的樣品溶解于優化后的溶劑體系中，進行高速逆流色譜分離。

經過高速逆流色譜分離后，在30～35 min收集到目標餾分，目標餾分HPLC色譜圖及組分含量如圖2、表5所示，在該時間段餾分中，幾乎沒有麥芽糖，M-β-CD純度由膜分離后的32.3%提高至93.2%，此時固定相保留率為60%，由此可證明HSCCC與膜分離技術聯用，是可行有效的分離純化M-β-CD的方法。

圖2 HSCCC目標餾分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of HSCCC target fraction

表5 目標餾分物質含量Table 5 Target fraction substance content

3 結論

利用HSCCC結合膜分離技術，通過探索膜分離條件及HSCCC溶劑體系，成功分離純化出麥芽糖基β-環糊精，純度為93.2%。該方法相較于曾報道的反相高效液相色譜法，具有處理量大，耗時短，操作簡便等優勢。本文探討了HSCCC新型溶劑體系中的一種，另外還存在離子液體、深共溶溶劑等新型極性溶劑體系，后續也可研究用于糖類分離中。