蒸發冷凝水經臭氧處理后回用于乙醇發酵的可行性研究

盛玄玄，張建華*，黃河，王秀葉

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(安徽中糧生化燃料酒精有限公司，安徽 蚌埠，233000) 3(濟南大學 生物學院，山東 濟南，250022)

燃料乙醇是備受世界各國關注的清潔能源之一。以陳化糧為原料發酵法生產燃料乙醇時，蒸餾廢液經固液分離、蒸發濃縮、干燥等工序聯產酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with solubles，DDGS)，有效解決了高濃度蒸餾廢液的污染難題。但DDGS生產過程中仍然會產生大量低化學需氧量(chemical oxyen demand，COD)濃度的蒸發冷凝水，直接排放會污染環境。目前，國內多數燃料乙醇生產企業采用好氧生化的處理方法，將蒸發冷凝水COD降解至0.5 g/L以下后進入城市污水管網，或進一步深度處理后達標排放。生化處理雖然解決了廢水污染問題，但衍生了生化剩余污泥的二次污染問題[1-2]，同時新鮮水資源浪費嚴重。

開發蒸發冷凝水資源化回用技術，實現蒸發冷凝水零排放，不僅能徹底消除蒸發冷凝水的污染問題，同時可以節約水資源，降低生產成本。蒸發凝結水直接回用拌料是最簡單的回用方式，但實驗證明蒸發冷凝水回用會降低乙醇發酵速率，有研究認為苯乙醇、糠醛是蒸發冷凝水中的主要抑制物[3-4]。

為了使蒸發冷凝水可以回用于乙醇發酵，研究者們嘗試了離子交換、樹脂吸附、反滲透以及它們兩兩組合的方法來處理蒸發冷凝水[5-7], 其中反滲透結合離子交換的處理方法，可以使蒸發冷凝水的回用率達到 87.5%[7]。但是反滲透存在膜污染、設備購置成本高以及需要消耗大量電力等問題。生物處理方法被廣泛應用到燃料乙醇廢水的處理上[8]，然而蒸發冷凝水的有機物濃度低，其COD值僅為1.045 g/L，因此現有的生物處理方法如厭氧消化并不適合處理蒸發冷凝水。綜上因素，研究者們正在探尋蒸發冷凝水再利用的新方法。

臭氧(O3)是一種強氧化劑，可以高效降解水體中的有機物[9-11]，O3也會在水中自行降解[12]，沒有二次污染的問題，且O3不需要昂貴的設備，被認為是一種經濟高效的有機物降解手段。ROZAS等[13]進行的O3降解有機微污染物(organic micropollutants, OMPs)實驗中，生長了24 h的水蚤在水體被氧化1 h后固定率降至20%。這表明O3對有機廢水具有很好的解毒作用。

基于已有的研究成果，本文采用O3氧化的方法處理蒸發冷凝水，并將氧化后的蒸發冷凝水回用于乙醇發酵，檢驗O3氧化技術在蒸發冷凝水資源化全回用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

酵母菌種為實驗室保藏；液體種子培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，115 ℃滅菌15 min。

1.1.2 實驗材料

市售大米；蒸發冷凝水(pH 3.6～3.9，略微渾濁，淡黃色或米白色，有類似酒糟的特殊氣味，COD值為1.045 g/L左右)，蚌埠中糧生化燃料乙醇有限公司；耐高溫α-淀粉酶(酶活力100 000 U/mL，最適作用溫度95 ℃，最適作用pH 5.5)、糖化酶(酶活力100 000 U/mL，最適作用溫度60 ℃，最適作用pH 5)，無錫杰能科公司。

1.1.3 儀器與設備

BF-CS-310臭氧發生器，廣州百豐環保科技有限公司；GCMS-QP2010 ULTRA氣質聯用儀，日本島津公司；戴安U-3000液相色譜儀，美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸發冷凝水的氧化處理

取250 mL蒸發冷凝水于錐形瓶中，以10 g/h通入O3, 反應溫度為25 ℃。

1.2.2 蒸發冷凝水的GC/MS分析

用濃H2SO4將蒸發冷凝水的pH調至與氧化后蒸發冷凝水相同，取樣進行GC/MS分析。

1.2.3 苯乙醇、糠醛、有機酸檢測

苯乙醇、糠醛[14-15]、有機酸[16]的檢測方法參照文獻。

1.2.4 乙醇發酵實驗

乙醇發酵實驗方法參照文獻[17-18]；乙醇含量的測定采用蒸酒法，酵母數采用血球計數板法計數，酵母活性檢測參照文獻[7]。

2 結果與分析

2.1 蒸發冷凝水全回用對乙醇發酵的影響

分別以自來水和蒸發冷凝水作為發酵工藝用水進行乙醇發酵，發酵30 h并定時取樣測定發酵系統的失重以及乙醇和甘油的產量。結果如表1所示，發酵系統的失重源自于乙醇發酵途徑產生的CO2的散失，單位時間內發酵系統的失重可以反映酵母的發酵速率。在發酵前12～30 h，蒸發冷凝水的發酵失重均低于自來水，表明蒸發冷凝水對乙醇發酵產生了明顯的不利影響，降低了乙醇發酵的速率。由于乙醇的產生與CO2的產生相關聯，因此發酵失重降低時乙醇的產量也相應的下降。其次，蒸發冷凝水作為工藝用水時，發酵副產物甘油的含量明顯高于自來水對照組。釀酒酵母產生甘油的行為通常被認為是其面對環境脅迫的一種應對機制[19]，因此進一步說明了蒸發冷凝水直接回用會對乙醇發酵產生抑制作用。

表1 蒸發冷凝水全回用對乙醇發酵的影響Table 1 Effect of the total reutilization of condensate on the ethanol fermentation

2.2 O3氧化后蒸發冷凝水的組分分析

由于蒸發冷凝水對乙醇發酵具有抑制作用，本文嘗試采用O3氧化的方法處理蒸發冷凝水以期消除其抑制性。氧化結束后首先采用GC/MS對蒸發冷凝水進行組分分析,如表2所示。

表2 O3氧化后蒸發冷凝水的GC/MS組分分析Table 2 Analysis of the condensate treated by O3 oxidation using GC/MS

由表2可以看出，氧化150 min后的蒸發冷凝水中醇類、呋喃類以及烯烴類化合物種類明顯減少，這表明O3對蒸發冷凝水具有良好的氧化效果。氧化后蒸發冷凝水中總檢出組分降低了18.8%，推斷此現象為有機組分在O3作用下發生化學轉化以及更進一步的無機化造成的。由于蒸發冷凝水組分復雜且歸一化法無法衡量各組分的實際濃度，因此單純的組分分析無法評估蒸發冷凝水的抑制性變化。所以還需進行乙醇發酵實驗觀察O3氧化后蒸發冷凝水的抑制性變化。圖1為O3氧化前后蒸發冷凝水的GC/MS總離子流圖。

a-氧化前;b-氧化后圖1 O3氧化后蒸發冷凝水GC/MS總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of the condensate treated by O3 oxidation using GC/MS

2.3 O3氧化后的蒸發冷凝水對乙醇發酵的影響

將氧化后的蒸發冷凝水回用于乙醇發酵實驗，并在處于指數期的24 h時測定發酵系統的失重、乙醇以及甘油的產量。已有研究認為蒸發冷凝水中苯乙醇、糠醛是抑制乙醇發酵的物質[3-4]，實驗發現在O3作用下蒸發冷凝水中的苯乙醇、糠醛隨氧化時間延長不斷被降解，反應結束時苯乙醇、糠醛的降解率分別達到99.5%、100% (圖2)。由于蒸發冷凝水中以苯乙醇、糠醛為代表的有機物不斷被降解，發酵系統的發酵速率以及乙醇產量逐漸得到恢復，同時甘油的產量也相應降低(表3)。實驗中我們注意到氧化處理150 min的蒸發冷凝水顯著提高了乙醇發酵速率并將乙醇產量提高了8.3% (表3)，這表明O3氧化處理不僅能解除蒸發冷凝水對乙醇發酵的抑制，而且對乙醇發酵具有促進作用。蒸發冷凝水的COD值并不高,僅有1.045 g/L，氧化結束后蒸發冷凝水的COD值僅降低了2.4%。由于O3氧化并不能將有機物完全無機化(表2，圖2)，所以推測O3氧化后蒸發冷凝水促進乙醇發酵的現象是O3氧化過程中產生的小分子物質作用的結果。

Ci-抑制物在i時刻的質量濃度;C0-抑制物初始質量濃度圖2 O3氧化過程中，蒸發冷凝水中苯乙醇、糠醛的濃度變化以及蒸發冷凝水COD值的變化Fig.2 Temporal variation of COD value and concentrations of phenylethanol, furfural in the O3 oxidation of condensate

2.4 O3氧化后的蒸發冷凝水促進乙醇發酵原因的初步探究

羧酸會在O3氧化有機物的過程中累積[12, 20]，通過對氧化后蒸發冷凝水中有機酸的監測發現氧化后蒸發冷凝水中乙酸、丙酸的含量明顯增加。反應結束后乙酸、丙酸含量分別升高16.3%、22.4%(圖3)。YANG等[17]研究發現當乙酸質量濃度低于1.5 g/L時，乙酸最高可以增加3%的乙醇產量，ZHANG等[18]發現在丙酸質量濃度低于2.2 g/L時，丙酸最高可以增加7.6%的乙醇產量，所以推斷乙酸、丙酸是氧化后蒸發冷凝水中促進乙醇發酵的物質。PAMPULHA等[21]研究發現一定濃度的羧酸可以提高酵母的底物消耗速率，并降低菌體的得率系數，所以隨著O3氧化的進行，由于乙酸、丙酸的積累發酵系統的酵母數出現了降低的現象(表4)，但是氧化后的蒸發冷凝水對乙醇發酵卻起到了促進的作用(表3)，也說明酵母的數量與乙醇發酵的好壞并沒有直接的關系。

圖3 O3氧化過程中蒸發冷凝水中有機酸的生成Fig.3 Profile of organic acids concentrations in the condensate during O3 oxidation

表3 O3氧化蒸發冷凝水回用乙醇發酵結果分析Table 3 Parameters of ethanol fermentation using condensate treated by O3 oxidation

為了進一步探究氧化后蒸發冷凝水促進乙醇發酵的機理，實驗中對酵母活性進行了鑒定。我們知道高活性酵母細胞處于旺盛生長狀態，而低活性酵母細胞則處于衰老、休眠的狀態。在乙醇發酵過程中酵母主要是在指數生長期快速轉化還原糖并產生乙醇，這一階段高活性酵母細胞比例最高，因此為了進一步觀察O3氧化后的蒸發冷凝水對酵母細胞的影響，實驗采用美藍染色法來統計高活性酵母細胞的比例，由實驗結果可以看出O3氧化150 min的蒸發冷凝水可以將指數生長期的高活性酵母細胞比例提高至95%，高于對照組的90%(表4)。

表4 O3氧化后蒸發冷凝水對酵母數以及酵母活性的影響Table 4 Effect of the condensate treated by O3 oxidation on yeast number and yeast activity

所以經過O3氧化的蒸發冷凝水中累積的乙酸、丙酸是O3氧化后的蒸發冷凝水促進乙醇發酵的誘因，即乙酸、丙酸的存在增強了乙醇發酵過程中酵母的活性，提高了還原糖的轉化效率進而對乙醇發酵產生了促進作用。

值得注意的是當對照組酵母細胞進入到衰退期后，蒸發冷凝水組高活性酵母細胞的比例出現了升高的現象(表4)，結合表1的實驗結果得出結論，蒸發冷凝水對乙醇發酵的抑制作用主要表現為降低了酵母細胞的活性進而延長了乙醇發酵周期，當然這種低效的生產方式是不能被工廠所采用的。

3 結論與討論

蒸發冷凝水直接回用會抑制乙醇發酵導致發酵速率降低，O3可以高效降解蒸發冷凝水中的抑制物苯乙醇、糠醛，進而減輕蒸發冷凝水對乙醇發酵的抑制性。蒸發冷凝水經O3氧化后產生的乙酸、丙酸等有機酸可以提高高活性酵母細胞的比例，同時降低細胞密度，高活性的酵母細胞提高了乙醇的發酵速率進而提高了乙醇的產量。實驗證明采用O3氧化的方法可以實現蒸發冷凝水的全部回用。