普魯蘭多糖/羧甲基殼聚糖復合膜的制備及其對羅氏沼蝦的保鮮效果

陳露珠，李念，裴諾，施文正,2，汪之和,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海)，上海，201306) 3(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)具有較好的安全性、成膜性、生物相容性、生物降解性和抗菌活性等特性，是一種較好的聚合物基質[1]。為了增強CMC保鮮膜的機械強度和保鮮性能，目前關于CMC與其他成分復配制備復合膜已成為國內外研究的熱點。ZIMET等[2]在CMC的膜液中加入乳酸鏈球菌素，所制成復合膜的理化性能和抗菌性能均得到提升。譚福能等[3]采用CMC/海藻酸鈉/納米二氧化硅復合涂膜保鮮草莓，使草莓水分有效保留并可降低其代謝。

普魯蘭多糖是出芽短梗霉利用糖發酵產生的胞外多糖，又名茁霉多糖[4-5]。普魯蘭多糖具有良好的成膜性、生物相容性以及降解性，最主要的特點是其膜透氣性要低于其他的高分子合成材料。近年來其涂膜已廣泛應用于食品保鮮[6-9]。胡云峰等[10]研究了普魯蘭多糖對雞蛋保鮮效果的影響，發現普魯蘭多糖水溶液能較好地在雞蛋表面形成涂膜層，阻止微生物進入和空氣接觸，減少失重，延長雞蛋的貨架期。有研究證實普魯蘭多糖在水產品中的保鮮應用也有良好的效果，用普魯蘭多糖保鮮白蝦可將保鮮期延長至8～9 d[11]。因此將普魯蘭多糖和CMC進行復配，可以制備出一種可食用、環保、性能優良的多糖復合保鮮膜。

本研究將普魯蘭多糖添加至CMC中，研究不同添加量的普魯蘭多糖對復合膜的理化性能和結構的影響,并用制備的復合膜液對羅氏沼蝦進行涂膜保鮮，在(4±1) ℃條件下貯藏，對羅氏沼蝦進行感官評價、揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)、pH值、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)值和菌落總數的測定，以研究復合膜對羅氏沼蝦的保鮮效果。本文可為CMC和普魯蘭多糖復配膜的進一步研究及其在食品中的開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CMC(取代度≥0.95)，實驗室自制；普魯蘭多糖(食品級)，浙江一諾生物科技有限公司；2-TBA、三氯乙酸、氫氧化鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氧化鎂(輕質)，皆為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

新鮮羅氏沼蝦，購于上海市浦東新區南匯新城鎮水產品店，30 min內運至實驗室。

1.2 儀器與設備

PHS-3CpH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；H2050R高速冷凍離心機，長沙湘儀有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Kjeltec2300全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；XLW(EC)型智能電子拉力試驗機，濟南蘭光機電技術有限公司；JB-1A型磁力攪拌器，上海精密科學儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司；Hitachi S-3400 N掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 南極磷蝦CMC的制備

將南極磷蝦殼粉與5%(質量分數)HCl以1∶10(料液比，下同)比例充分混合，在室溫下反應1 h后用蒸餾水洗滌至中性，然后按1∶10比例加入4%(質量分數)NaOH溶液，在100 ℃下反應1 h后用蒸餾水洗滌至中性，再按1∶10的比例加入45% NaOH溶液，150 ℃條件下處理5 h后用蒸餾水洗滌至中性并放置真空干燥箱(60 ℃)烘干，即得到南極磷蝦殼聚糖。以上步南極磷蝦殼聚糖質量為準，加入異丙醇(料液比1∶12)溶脹1 h，按1∶10比例加入40%NaOH溶液，于30 ℃下攪拌1 h，然后再按1∶10比例加入50%(體積分數)氯乙酸-異丙醇溶液，微波處理(微波功率540 W)25 min后，再按1∶10比例加入40%NaOH溶液，在50 ℃ 條件下反應1 h后用鹽酸溶液調pH值至7.0。離心(10 000 r/min)5 min后取上清液并加入無水乙醇靜置30 min，使CMC完全沉淀析出，最后用甲醇多次洗滌后放置真空干燥箱(60 ℃)烘干，即得到南極磷蝦CMC，取代度為0.95。

1.3.2 普魯蘭多糖-CMC(pullulan CMC，CP)復合膜的制備

在25 ℃下完全溶解CMC后，加入不同濃度的普魯蘭多糖攪拌至完全溶解；將混合膜液超聲20 min去除氣泡；利用流延法將超聲后的混合膜液(40 mL)在成膜板(17 cm×17 cm×2 cm)上于真空干燥箱中干燥成膜(50 ℃，24 h)，所成膜保存于恒溫恒濕(25 ℃，53%)的干燥器中穩定48 h，等待檢測。每種類型的薄膜至少制備3片膜。具體見表1。

表1 復合膜中普魯蘭多糖和CMC的添加量及其命名Table 1 The dosage of pullulan polysaccharide and CMC in composite membrane and its naming

1.3.3 拉伸強度與斷裂伸長率

根據VUDDANDA等[12]的方法并稍作修改，將膜裁成150 mm×15 mm的長條，設置初始上下夾片距離為50 mm，拉伸速率50 mm/min。記錄薄膜的拉伸強度和斷裂伸長率，每個樣品測定6次，取其平均值。

1.3.4 水蒸氣透過系數

取20 mL蒸餾水倒入50 mL燒杯中，用膜包覆杯口并用細皮筋進行固定，在22 ℃條件下，放入含有硅膠的干燥器中。每隔2 h稱量，稱取6次，每組膜取3個平行樣品，按照公式(1)計算水蒸氣透過系數[13]。

(1)

式中：x為膜厚，mm；S為有效面積，S=16.61×10-4m2；Δm為水分透過的質量，g；t為間隔時間，s；ΔP為膜兩邊的壓強差，ΔP=3 167 Pa(25 ℃)

1.3.5 透光率

使用紫外可見分光光度計評估薄膜的透明度。選取光滑、平整和潔凈的膜，將膜切成矩形，緊貼在比色皿的內側。以空皿作為空白對照，在600 nm處測定其透光率，用透光率的大小來表征復合膜透明度。透光率越高，表明膜的透明度越高。

1.3.6 傅里葉紅外光譜

采用KBr壓片法，將膜烘干剪碎后與溴化鉀混合，研磨均勻后壓片，在400～4 000 cm-1內掃描，掃描速率為4 cm-1，掃描次數為32次。并記錄各樣品的紅外光譜。

1.3.7 掃描電鏡觀察

將膜在干燥器中干燥一段時間后，將其裁剪成5 mm×5 mm的大小，用導電膠將膜固定在銅板上，真空噴金處理。采用掃描電子顯微鏡觀察膜表面形態。

1.3.8 CP保鮮復合膜羅氏沼蝦的保鮮效果

選用最優性能CP復合膜配方對羅氏沼蝦進行涂膜處理，研究復合膜對羅氏沼蝦保鮮效果的影響。

將鮮活羅氏沼蝦浸沒在冰水中致其昏死，挑選個體大小一致，蝦體完整的羅氏沼蝦，在不同膜液中浸漬10 min，處理后快速分裝于聚乙烯保鮮袋，并用封口機封口，放置在(4±1) ℃生化培養箱中進行保鮮實驗，每隔2 d取樣進行指標測定。以未涂膜的羅氏沼蝦作為對照組(CK)。

1.3.8.1 感官評價

感官評定由6名有感官評定經驗的人員組成，分值由高到低為9～0分，對羅氏沼蝦從肌肉組織、體表色澤和氣味等方面進行評分，具體評分標準見表2。

表2 羅氏沼蝦綜合感官評分表Table 2 Sensory evaluation of Macrobrachium rosenbergii

1.3.8.2 TVB-N的測定

按照GB/T 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[14]進行測定。

1.3.8.3 肌肉pH值

稱取2.00 g樣品，加入10 mL蒸餾水，均質 1 min 后進行冷凍離心10 min(10 000 r/min、4 ℃)，過濾后取上清液進行pH值測定[15]。

1.3.8.4 TBA值測定

準確稱取1.00 g樣品，加入4 mL蒸餾水和5 mL三氯乙酸溶液(20%，質量分數)，均質1 min，靜置1 h 后冷凍離心10 min(8 000 r/min，4 ℃)。過濾取其上清液定容至10 mL，取其5 mL并加入5 mL TBA溶液(0.02 mol/L)，迅速搖勻并置于沸水中加熱20 min后，進行流水冷卻5 min，測其吸光度A(532 nm)。用蒸餾水作空白實驗，每組樣品平行測定3次。TBA值=A×7.8，以mg/100g表示[16]。

1.3.8.5 菌落總數

按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗-菌落總數測定》[17]進行測定。

1.3.9 數據處理與分析

每組實驗進行3個平行，實驗數據采用Excel軟件進行計算，以SPSS 23.0進行統計分析，在單因素方差分析(ANOVA)的基礎上，采用Duncan法多重比較。運用Origin 9.1繪圖。

2 結果與分析

2.1 抗拉伸強度和斷裂伸長率

復合膜的機械性能用抗拉強度和斷裂伸長率這2個指標來表征。其中抗拉強度反映了膜的力學強度，而斷裂伸長率是反映膜的柔韌性的指標[18]。圖1顯示了不同配比復合膜的抗拉強度和斷裂伸長率。

圖1 不同配比對復合膜抗拉伸強度和斷裂伸長率的影響Fig.1 The effect of different ratios on the tensile strength and elongation at break of the compositefilm注：抗拉伸強度的平均值間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，斷裂伸長率的平均值間不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)

隨著普魯蘭多糖含量的增加，復合膜的抗拉強度呈現先增加后減少的趨勢。其中CP2組的抗拉強度最大，為14.36 MPa，顯著高于其他組復合膜(P<0.05)，比CMC膜高98.34%。說明具有較強的抗拉強度，這為CMC中的羧基與普魯蘭多糖中的羥基之間所形成氫鍵作用所致，隨著復合膜中普魯蘭多糖比例的增加，羥基的數目也相應增加了，從而增強了多糖分子間的氫鍵作用。CP組復合膜的斷裂伸長率均高于CMC膜，說明普魯蘭多糖的加入可以增強CMC膜的柔韌性。其中CP1，CP2和CP4組的斷裂伸長率無顯著性差異(P>0.05)。綜合考慮，CP2組的機械性能較好。

2.2 水蒸氣透過系數

水蒸氣透過系數的大小反應了復合膜透濕性的高低，而透濕性的高低會直接影響到對產品的包裝效果，透濕性越低，即水蒸氣透過系數越小，說明膜的阻水性越好，則越有利于食品的保鮮[19-20]。圖2為不同配比復合膜的水蒸氣透過系數。隨著普魯蘭多糖添加量增加，復合膜的水蒸氣透過系數先降低后增大，其中CP2組復合膜的水蒸氣透過率最小，為2.32×10-12g/(m·s·Pa)，顯著低于其他組復合膜(P<0.05)，且比CMC膜的水蒸氣透過系數低12.5%，說明CP2組復合膜的透濕性最低，最有利于食品保鮮。

圖2 不同配比對復合膜水蒸氣透過系數的影響Fig.2 The effect of different ratios on the water vapor transmission coefficient of composite membranes注：圖中不同復合膜配比的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 透光率

復合膜的透光率通常是判斷共混高分子材料相容性好壞的輔助手段，若復合膜中2種多糖相容性很差，則在相界面上由于光的散射或反射而使膜的透光率降低[21]。圖3為不同配比復合膜的透光率的變化。隨著普魯蘭多糖添加量的增加，復合膜的透光率增大，并呈現顯著上升的趨勢(P<0.05)，這是因為普魯蘭多糖為白色物質，CMC為淡黃色物質，普魯蘭多糖比例的增加會提高復合膜液透明度。所有復合膜的透光率均大于90%，顯著高于CMC膜，說明復合膜中2種多糖有較好的相容性。

圖3 不同配比對復合膜透光率的影響Fig.3 The influence of different ratios on the light transmittance of the composite film

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜可以反映出各組分的特征基團和相互作用，尤其是氫鍵的作用，已被廣泛地應用于表征共混物之間的相容性。相容的共混物之間有強相互作用，其產生的光譜相對于各組分的光譜產生較大的偏差，由此體現物質的相容性[22]。

圖4為不同配比復合膜的紅外光譜圖。CMC膜在3 452 cm-1處有強吸收峰，是—OH和—NH2的特征吸收峰，可以反映出—OH和—NH2分子內和分子間氫鍵。CP1，CP2，CP3和CP4復合膜在此處也有強吸收峰，CP4膜在此處的吸收峰有明顯增強，這說明普魯蘭多糖的加入增強了—OH和—NH2分子內和分子間氫鍵作用。CMC膜在2 830 cm-1處的吸收峰是C—H伸縮振動吸收峰，隨著普魯蘭多糖的加入，CP復合膜的吸收峰均向更高波數偏移(CP1膜為2 831 cm-1，CP2膜為2 838 cm-1，CP3膜為2 846 cm-1，CP4膜為2 902 cm-1)，表明普魯蘭多糖和CMC之間存在強烈的氫鍵作用。CMC膜在1 617 cm-1處的吸收峰為羧基的不對稱振動，CP組復合膜發生了偏移。CMC膜在1 369 cm-1處的吸收峰為羧基的對稱振動，CP組復合膜的吸收峰發生偏移，可能是因為CMC中的羧基與普魯蘭多糖的羥基之間存在氫鍵作用。由于普魯蘭多糖添加量的增加，CP4組在1 391 cm-1處出現了1個新峰，這是因為普魯蘭多糖中C—O的伸縮振動。這些基團的變化可能導致復合膜的物理和化學性質的變化。由于從紅外圖譜中證明普魯蘭多糖和CMC之間存在氫鍵作用，這可以在一定程度上說明復合膜具有比較良好的相容性。

圖4 不同配比復合膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of composite films with different ratios

2.5 掃描電鏡分析

利用掃描電鏡放大500倍觀察CMC、CP1、CP2、CP3和CP4的表面形態結構(圖5)。純CMC膜(圖5-a)表面平滑，但呈現大量纖維狀物質。隨著普魯蘭多糖的加入，膜的表面變得光滑，纖維狀物質減少。圖5-c和圖5-d表面光滑，無纖維狀；圖5-e存在少量微纖維狀物質。所有薄膜的表面微觀結構不存在任何的裂隙和小孔，為均勻、光滑的表面形態，無明顯相分離現象，表現出很好的相容性。

a-CMC；b-CP1；c-CP2；d-CP3；e-CP4圖5 不同配比復合膜的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of composite films with different ratios

2.6 復合膜對羅氏沼蝦保鮮效果的分析

2.6.1 感官評價變化

圖6為不同處理組的羅氏沼蝦在4 ℃低溫保鮮過程中感官評分的變化。隨著保鮮時間的延長，各處理組羅氏沼蝦的感官評分逐漸降低。羅氏沼蝦在貯藏過程中產生的氣味和色澤黑變，是由于自身內源酶和微生物的作用，導致蝦體內的脂質氧化和蛋白質降解所致[23]。在0～8 d的貯藏過程中，CP2組和CMC組的感官評分始終高于CK組。這是因為膜液處理對羅氏沼蝦的保鮮起到了一定的作用。在保鮮前4 d，CMC組和CP2組的感官評分并無明顯差異(P>0.05)。在保鮮后期(6～8 d)時，CP2組的感官評分顯著高于CMC組(P<0.05)。說明CP2組的復合膜液對羅氏沼蝦的保鮮效果優于CMC單一膜液。這主要是因為復合膜的機械性能好，水蒸氣透過系數低，能有效抑制微生物生長，降低脂質氧化和蛋白質降解的速率，從而抑制羅氏沼蝦在貯藏過程中的腐敗變質，維持羅氏沼蝦的感官質量。

圖6 羅氏沼蝦保鮮過程中感官評分的變化Fig.6 Changes in sensory scores during the preservation of Macrobrachium rosenbergii注：不同貯藏時間的不同組別間的上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6.2 TVB-N變化

TVB-N是在水產品貯藏過程中，由于微生物和酶的作用，蛋白質被分解產生氨氣及揮發性胺類物質，是評價水產品新鮮程度的重要指標之一[24]。圖7為不同處理組對羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中TVB-N的變化。隨著保鮮時間的延長，各處理組的TVB-N值均呈現上升趨勢，其中CK組的TVB-N值顯著高于CMC組和CP2組(P<0.05)，CK組樣品TVB-N值[(20.48±0.25) mg/100g]已超過國家規定的限量值20 mg/100g。在保鮮到第8天時，CMC處理組和CP2處理組的TVB-N值分別為(21.26±0.20)和(19.92±0.31) mg/100g，比CK組延長4 d左右，這不僅因為CMC可以抑制微生物生長，從而降低羅氏沼蝦體內蛋白質被分解的速率，還因為CP2膜的機械性能和水蒸氣透過系數優于CMC膜，可以更有效地阻止外界空氣和水，防止外界微生物的進一步侵染繁殖。

圖7 羅氏沼蝦保鮮過程中TVB-N的變化Fig.7 Changes in TVB-N during the preservation of Macrobrachium rosenbergii

2.6.3 pH變化

圖8為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中pH的變化。隨著貯藏時間的延長，所有處理組的pH值呈現上升的趨勢。這與羅氏沼蝦在內源酶和微生物的作用下，體內蛋白質被分解產生一系列堿性化合物有關，如三甲胺，組胺，吲哚等，進而導致各處理組pH值的持續上升[25]。在貯藏過程中，CP2組的pH值始終低于CK組和CMC組。在貯藏到第8天時，CK組的pH值已上升至8.30，與CP2組區別顯著(P<0.05)。說明CP2組的復合膜液在貯藏過程中可以更有效地控制內源酶和微生物的作用，抑制pH值上升，從而延長羅氏沼蝦的貯藏時間。

2.6.4 TBA值變化

圖9為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中TBA值的變化。隨著貯藏時間的延長，所有處理組的TBA值呈現上升的趨勢。TBA值越大，脂肪氧化程度越高，水產品腐敗程度越嚴重[26-27],因此常根據TBA值的變化來判斷水產品脂肪氧化程度。貯藏8 d 時，CK組的TBA值從0.26 mg MDA/100g增加到1.25 mg MDA/100g；而CMC組和CP2組分別增加到0.94和0.83 mg MDA/100g，說明CMC和CP2膜液能夠在一定程度上抑制羅氏沼蝦的脂肪氧化。其中CP2處理組的TBA值顯著低于其他處理組(P<0.05)。這是因為加入的普魯蘭多糖使復合膜液的成膜性能更好，水蒸氣透過系數更低，具有了良好的阻氧性，進而抑制蝦體的脂質氧化，起到一定的保鮮作用。

圖9 羅氏沼蝦保鮮過程中TBA值的變化Fig.9 Changes in TBA value during the preservation of Macrobrachium rosenbergii

2.6.5 菌落總數變化

水產品的腐敗變質主要是因為微生物的繁殖所導致，所以菌落總數可以作為衡量水產品腐敗情況的重要指標之一[28]。圖10為不同處理組羅氏沼蝦在4 ℃貯藏過程中菌落總數的變化。隨著貯藏時間的延長，CK組的菌落總數一直呈現快速上升的趨勢，而CMC組和CP2組的菌落總數則呈現先下降后上升的趨勢。這可能是因為在保鮮初期，羅氏沼蝦本身所攜帶的細菌受低溫和保鮮膜液的雙重抑制，生長出現延滯期，而后隨著貯藏時間延長，細菌逐漸適應了環境，耐冷微生物不斷繁殖，以致菌落總數逐漸上升[29]。在貯藏8 d的過程中，CK組的菌落總數由4.81 lgCFU/g上升至5.86 lgCFU/g，CMC組和CP2組的分別上升至5.50 lgCFU/g和5.37 lgCFU/g。CP2組的菌落總數明顯低于CMC組(P<0.05)，說明CP2組的復合膜液對羅氏沼蝦的抑菌效果更好，能更有效地延緩腐敗變質。

圖10 羅氏沼蝦保鮮過程中菌落總數的變化Fig.10 Changes in the total number of colonies during the preservation of Macrobrachium rosenbergii

3 結論

普魯蘭多糖和CMC復配能有效改善單一CMC膜的性能。結果顯示，加入1%普魯蘭多糖與1%CMC按1∶1復配后，復合膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率明顯增加，水蒸氣透過系數顯著降低，透光率增高，說明能制備出性能優良的復合膜。將復合膜應用于羅氏沼蝦的保鮮試驗上，發現復合膜能顯著降低其TVB-N、pH值、TBA值和菌落總數，可將羅氏沼蝦的貨架期由4 d延長至8 d，說明復合膜對羅氏沼蝦具有良好的保鮮效果。