花椒精油對蘋果梨采后青霉病的控制及感官和質地品質的影響

王聰，沈浩，蒲國順，任麗, 李貞子，王軍節*

1(北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川，750021)2(北方民族大學 植物性農產品貯藏與加工重點實驗室，寧夏 銀川，750021)3(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730124)

蘋果梨是我國甘肅[1]、內蒙[2]和吉林地區[3]的特產水果，該果含糖豐富、質地酥脆，在國內外市場頗具盛譽[4]。由擴展青霉(Penicilliumexpansum，P.expansum)侵染引起的青霉病[5]和鏈格孢(Alternariaalternata，A.alternata)侵染引起的黑斑病[1,6]是蘋果梨主要采后病害，給果實貯藏造成嚴重損失。P.expansum和A.alternata引起果實腐爛過程還常伴隨展青霉毒素和交鏈孢霉毒素的積累，帶來食品安全隱患[7]。因此，開發蘋果梨采后病害控制策略將有利于產業健康發展。

殺菌劑可以控制P.expansum[8]和A.alternata[9]引起的采后病害，但存在藥物殘留、環境污染以及誘導病原菌產生抗藥性等問題而受限。近些年越來越多研究表明，植物精油是替代殺菌劑控制采后病害的新型安全措施[10-12]。花椒為蕓香科花椒屬植物的成熟干燥果實，精油是其開發利用的重要方向[13]。研究發現花椒精油對引起馬鈴薯干腐病的硫色鐮刀菌[14]和引起牧草和煙葉貯藏蟲害的煙草甲[15]以及食品衛生指示菌大腸桿菌[16]具有較好抑制效果。但有關花椒精油控制蘋果梨采后病害的研究鮮見報道。

本研究在篩選花椒精油體外控制引起蘋果梨采后腐爛病菌A.alternata和P.expansum的基礎上，進一步以精油控制效果更佳的P.expansum為研究對象，在單因素試驗基礎上，對精油濃度和熏蒸時間進行響應面優化，篩選精油體內控制蘋果梨采后青霉病的最佳條件，并對使用后果實的感官和質地品質進行測定分析，以期為花椒精油的開發應用提供理論依據，也為蘋果梨采后青霉病控制提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：供試A.alternata和P.expansum分離自然發病果實，純化后于實驗室保存待用；花椒精油采用水蒸氣蒸餾法提取備用[17]；蘋果梨果實采自甘肅省條山農場，當天運抵實驗室待用。

主要儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺，廣州深華公司；BMJ-800C霉菌培養箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；YXQ-LS-50A高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TMS-PRO質構儀，美國FTC公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原物的篩選與體外抑菌率測定

采用濾紙片熏蒸法，配制一定濃度花椒精油溶液(吐溫-80作為助溶劑)，稀釋成可在培養皿內揮發之后含量達到50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μL/L的溶液[8]，助溶劑作為對照。將配置好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)分裝到錐形瓶中進行滅菌，在超凈工作臺內將滅菌的PDA培養基用滅菌量筒量取25 mL分裝到滅過菌的培養皿中。將直徑6 cm滅菌的濾紙片置于培養皿蓋上方中心固定，在濾紙片上滴加先前配制好的1 mL花椒精油溶液并使其均勻分布，在已經純化且長勢良好的帶菌培養皿的同一直徑范圍內，用滅菌的打孔器打取生長一致的菌餅(直徑為6.0 mm)，將菌餅置于培養基中心，蓋上含有精油濾紙的玻璃皿蓋，并立即用封口膜進行封口處理，置于28 ℃霉菌培養箱中正置培養72 h后用十字交叉法測量菌落直徑[18]，每處理重復5次。通過公式(1)計算抑菌率，選取花椒精油對其抑制率高的病原菌進行下一步試驗[19]。

(1)

1.2.2 對蘋果梨病原菌生長抑制的工藝優化

1.2.2.1 單因素實驗設計

參考韓艷麗等[10]的方法稍作修改。選擇成熟度和大小一致，無病蟲害，無機械損傷的蘋果梨果實，用體積分數為70%的酒精對蘋果梨果實進行表面消毒，先用滅菌后的鐵釘在果實赤道部分等距離刺4個3 mm深的傷口，每個傷口內注入10 μL 1×106個/mL的孢子懸浮液，分別對花椒精油熏蒸時間(含量為10 μL/L的精油密閉熏蒸2、4、6和8 h)和(分別用10、20、30和40 μL/L的精油熏蒸2 h)進行單因素熏蒸處理后，打開密閉容器通風平衡24 h，最后放入(25±2) ℃、85%相對濕度(relative humidity，RH)條件下貯藏5 d，采用十字交差法測量果實的病斑直徑，記錄數據并分析，探討熏蒸時間和不同含量的花椒精油對P.expansum的體內抑制效果，每次處理用果8個，重復3次。

1.2.2.2 響應面實驗設計

在單因素實驗結果的基礎上，采用Central Composite Design設計[20]優化精油最佳處理方式。如表1所示，對熏蒸時間和精油含量兩因素分別用A和B表示，每一自變量低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。

表1 響應面實驗設計因素與水平Table 1 Design factors and level of central composite

1.2.3 花椒精油處理對蘋果梨品質的影響

通過工藝優化得到花椒精油熏蒸蘋果梨最佳時間和含量的組合，然后將成熟度和大小一致、無病蟲害、無機械損傷的蘋果梨果實在最佳的含量和時間條件下進行熏蒸，同時以助溶劑處理為對照，并將2組果實在(25±2) ℃、85%RH條件下貯藏，于處理當天(0 d)、1、7、14和21 d分別取果實測定感官和質地品質[21]，每次處理用果15個，重復3次。

1.2.3.1 感官分析評價

對蘋果梨感官評定過程中，每次評定由每位評定成員單獨進行評分記錄，相互不接觸交流，不同果實樣品評定間隔期間用清水漱口。本試驗感官評價中，每項滿分為5分，選取色澤、味覺、質地、香氣4項指標綜合得到最后的總體得分[22]。單項指標的評判尺度及統計如下：

色澤：光鮮(5分)～暗灰(1分)；味覺：脆嫩(5分)～綿軟(1分)；質地：汁液充分(5分)～干澀(1分)；香氣：無花椒味，果實香氣濃郁(5分)～花椒味濃，果實香氣較淡(1分)。實驗選取10位人員組成評定小組進行感官評價，評定結果去掉2個極值后取平均值為最終評價結果。

1.2.3.2 質地品質測定

先調試好質構儀，測定參數設定：測試速度為30 mm/min；下壓形變量為10%；觸發力為0.1 N[23]。在每個果實的陰面、陽面以及中間對稱4個點的赤道部位分別切去一小塊果實表皮，露出果肉(表面平整)，然后用質構儀進行測定。質構特性以硬度、黏著性、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性等指標表示[24]。

1.3 數據統計分析

所有數據采用GraphPad Prism 5.0進行作圖、方差分析以及顯著性分析(P<0.05)，相關性分析采用SPSS 21.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 花椒精油對P.expansum和A.alternaria體外抑菌效果

由圖1可知，不同含量花椒精油對2種病原菌生長均有抑制作用，且抑制效果存在差異。精油對2種病原菌抑制率均隨著含量增大而升高，當含量大于6.25 μL/L時，精油對2種病原菌抑制效果差異顯著，對P.expansum抑制率顯著高于A.alternata，在含量為25 μL/L時，對P.expansum抑制率是對A.alternata抑制率的2.1倍。由此表明，花椒精油對2種病原均有抑制作用，其中對P.expansum抑制效果更明顯。

圖1 不同含量花椒精油對P.expansum和A.alternata的體外生長抑制率Fig.1 Inhibitory ratio of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on P.expansum and A.alternata in vitro注：不同字母表示P<0.05水平的差異顯著(下同)

2.2 控制蘋果梨青霉病的花椒精油熏蒸時間和含量的單因素試驗

2.2.1 熏蒸時間的單因素試驗

根據2.1結果，以P.expansum為研究對象，進一步優化花椒精油控制果實采后青霉病的體內應用條件。圖2看出，不同熏蒸時間均對P.expansum的體內生長存在抑制作用，但不同熏蒸時間之間存在差異，且損傷接種果實的病斑直徑隨熏蒸時間延長呈現先降低后增加趨勢。當熏蒸時間為4 h，病斑直徑達到最小值，為8.59 mm。因此，熏蒸時間優化取值確定為2、4和6 h。

圖2 花椒精油熏蒸時間對病斑直徑的影響Fig.2 Effect of fumigation time of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter

2.2.2 熏蒸濃度的單因素試驗

花椒精油含量對損傷接種蘋果梨青霉病控制效果不同，病斑直徑隨精油含量增加呈先減小后增加隨后又略有減小趨勢(圖3)。當精油含量為10 μL/L時，病斑的直徑最小，為11.19 mm，抑制效果最好。雖然精油含量在30 μL/L時，病斑直徑又呈減小趨勢，但處理的果實略有藥害斑點發生。因此，含量應控制在30 μL/L以內為宜。故熏蒸果實精油含量的優化確定為5、10和15 μL/L。

圖3 花椒精油含量對病斑直徑的影響Fig.3 Effect of fumigation concentration of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter

2.3 控制蘋果梨青霉病的花椒精油熏蒸條件優化

2.3.1 響應面實驗結果與分析

以熏蒸時間(A)和花椒精油含量(B)為自變量，以損傷接種P.expansum的果實病斑直徑為因變量(Y)，響應面-中心組合設計實驗方案和結果見表2。采用軟件Design-Expert 8.0.6 對實驗結果進行二次多元回歸擬合和方差分析，得到果實病斑直徑對熏蒸時間及精油含量的回歸方程為:

表2 Central composite實驗設計及結果Table 2 Central composite experimental design and results

Y=10.08-0.48A-0.68B-0.45AB+0.17A2+0.46B2

表3 試驗方差結果分析表Table 3 Test variance results analysis table

2.3.2 驗證性實驗

根據Central Composite實驗設計得到抑制青霉病斑擴展的最佳參數為：熏蒸的時間為5.61 h，花椒精油的含量為14.24 μL/L，此條件下果實的病斑直徑預測值為9.89 mm。為了驗證模型的準確性，將處理條件修正為：熏蒸時間5.6 h，花椒精油含量14.2 μL/L，并進行3次驗證性實驗，實際測量出病斑直徑為(10.04±0.23)mm，與理論值接近，說明模型的擬合程度較好，回歸方程對處理條件進行分析和預測可靠，可以利用該條件對體內P.expansum的生長進行抑制，用于蘋果梨的采后處理。

2.4 花椒精油處理對蘋果梨貯藏品質的影響

2.4.1 花椒精油處理對蘋果梨感官品質的影響

由圖4可知，花椒精油處理蘋果梨在貯藏期間果實色澤、味覺以及質地品質的影響整體趨勢一致。在貯藏期間，隨著貯藏時間延長，處理和對照之間果實色澤、味覺和質地品質均未出現顯著差異；但貯藏前14 d的處理果實香氣得分顯著低于對照組，這是由于花椒精油本身的揮發性氣味掩蓋了果實香氣所致，但在貯藏21 d時，處理與對照之間的香氣評分(P=0.04<0.05)無顯著差異。

A-色澤；B-味覺；C-質地；D-香氣圖4 精油處理對蘋果梨感官品質的影響Fig.4 Effect of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on sensory evaluation of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli

2.4.2 果實質構指標間相關性分析

通過全質構分析，測定對照和處理在貯藏過程中的質構參數，并對質構參數用SPSS統計軟件進行相關性分析，結果如表4所示，質構實驗所得到的蘋果梨的各項物性指標間相關性不同。以蘋果梨的硬度指標作為參考，分析其他指標與其相關性，結果表明，脆度、彈性與硬度呈正相關，且達到顯著水平；膠黏性、凝聚性、黏著性與硬度呈負相關，并且都達到顯著水平。因此在本次測試中，脆度、彈性、膠黏性、凝聚性、黏著性指標能和硬度一起反映果實的質地變化情況。

表4 質構試驗所得各項質地參數間的相關性(R)矩陣表Table 4 Correlation (R) matrix table between texture parameters obtained from texture tests

2.4.3 花椒精油處理對果實硬度、脆度和彈性的影響

如圖5所示，隨著貯藏時間延長，果實硬度、脆度與彈性均呈下降趨勢；處理組與對照組之間的脆度、硬度與彈性在14 d之前均未出現顯著差異(圖5-A，圖5-B)；在貯藏第21天時，處理組可顯著抑制果實硬度與脆度的降低，處理組硬度和脆度分別比同期對照高25.5%和42.8%；然而，整個貯藏期間處理與對照之間的彈性值無顯著差異。因此，精油處理抑制了貯藏后期果實硬度和脆度的下降。

A-硬度；B-脆度；C-彈性圖5 花椒精油處理對蘋果梨果實硬度、脆度和彈性的影響Fig.5 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on hardness, brittleness and springiness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli

2.4.4 花椒精油處理對果實膠黏性、凝聚性和黏著性的影響

如圖6所示，果實的膠黏性、凝聚性和黏著性隨著貯藏時間的延長而呈現上升趨勢；處理與對照之間的膠黏性在14 d之前均未出現顯著性差異，在貯藏第21天時，處理可顯著抑制果實膠黏性的升高，處理組比同期對照組低10.6%；黏著性在第14天時開始出現顯著性差異，在第14、21天時處理組比同期對照組分別低48.2%和8%；而凝聚性在貯藏過程中并未出現顯著性差異。因此，精油處理抑制了貯藏后期果實膠黏性和黏著性的升高。

A-膠黏性；B-凝聚性；C-黏著性圖6 花椒精油處理對蘋果梨果實膠黏性、凝聚性和黏著性的影響Fig.6 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on gumminess, cohesiveness and adhesiveness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli fruit

3 討論與結論

體外抑菌研究結果表明，花椒精油對P.expansum和A.alternata均有明顯的體外抑制作用，且對P.expansum的抑制效果優于A.alternata，與花椒精油可抑制F.sulphureum體外生長的研究結果一致[14]。前人研究表明，檸檬烯、芳樟醇和α-蒎烯為花椒精油的主要成分[25-27]，且檸檬烯和芳樟醇均具有抑制禾谷鐮刀菌和灰葡萄孢的體外生長能力[28]，α-蒎烯可抑制禾谷鐮刀菌的體外生長[14]。因此，花椒精油對P.expansum和A.alternata的體外生長抑制可能與檸檬烯、芳樟醇和α-蒎烯等主要成分的抑菌作用有關。響應面優化試驗得出含量14.2 μL/L的花椒精油、熏蒸5.6 h為體內控制蘋果梨青霉病的最佳條件，與含量分數15 μL/L的肉桂精油熏蒸櫻桃果實可顯著延緩果實腐爛和品質下降的結果相似[7]。

花椒精油對貯藏過程中蘋果梨果實的色澤、味覺和質地等品質無顯著性影響，但花椒精油的刺激性氣味顯著影響了貯藏前期果實的香氣，然而，隨著花椒精油的揮發和果實香氣的釋放，貯藏后期精油未對果實香氣品質造成顯著影響，但如何降低花椒精油對果實香氣品質的影響仍是今后應用的改進方向。果實質地是用來表示果實組織狀態以及食用時口感的內在品質，也是果實商品性的重要評價指標[29]。與早酥梨質構多面性評價不同[24,30]，脆度、膠黏性、黏著性和硬度均可用于表示蘋果梨質地品質的變化，且花椒精油可延緩貯藏后期蘋果梨果實脆度和硬度下降，抑制后期果實膠黏性和黏著性的升高。因此花椒精油可用于蘋果梨果實采后青霉病控制，研究結果可為蘋果梨的采后貯藏保鮮提供新思路。