快速濾過型凈化法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量

高曉敏，王琚鋼，馬智玲，嚴(yán)程明，陳吳海

1(銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁，554300)2(貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室(銅仁學(xué)院), 貴州 銅仁，554300)3(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江，524091)4(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湛江試驗站，廣東 湛江，524013)5(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江，524000)

孔雀石綠(malachite green，MG)和結(jié)晶紫(crystal violet，CV)均屬于三苯甲烷類染料，最先應(yīng)用在紡織工業(yè)上[1]，但同時因具有廣譜抗菌、便宜及藥效顯著等特點，曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖和運輸過程中，預(yù)防和治療水產(chǎn)品細(xì)菌性感染疾病[2]。水產(chǎn)品的組織中能夠富集此類藥物，且當(dāng)藥物進入生物體內(nèi)會通過生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生毒性更強的隱性孔雀石綠 (leucomalachite green，LMG)和隱性結(jié)晶紫(leucocrystal violet，LCV)[3]，其在水產(chǎn)品體內(nèi)的代謝速率較為緩慢，殘留時間較長，難以消除，研究表明，長期食用此類水產(chǎn)品，很容易引起人體部分臟器和組織中毒，產(chǎn)生“三致”等副作用，嚴(yán)重威脅人體健康[4]。

為此，美國、歐盟、日本等多國已禁止MG、CV在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖及運輸過程中使用[5]，我國也將其列為禁用藥物，要求在動物性食品中不得檢出[6]。但因治療效果顯著，價格低，使得其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖、運輸?shù)韧緩街袑医恢埂Ｄ壳八a(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的分析方法主要包括：高效液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、電化學(xué)法[11]等，其中液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的應(yīng)用最為普遍。目前檢測該藥物的國標(biāo)方法有GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法》[12]和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[13]。液相色譜法一般將MG用硼氫化鉀還原為LMG，利用其具有熒光性而使用熒光檢測器進行分析[14]；或?qū)MG通過二氧化鉛進行柱后衍生氧化為MG，使用紫外或二極管陣列檢測器檢測[15]。與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，高效液相色譜法的檢出限相對較高，當(dāng)目標(biāo)物在樣品中的含量較低時，僅僅依靠保留時間進行定性的局限性很大，而串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度和專屬性較高、簡便快速、干擾少、可避免假陽性等優(yōu)點，成為眾多研究者首選的測定方法[16]。

目前，針對水產(chǎn)品中藥物殘留檢測的樣品前處理方法主要有固相萃取法[17]、還原法[13]、柱后衍生法[15]、液液萃取法[18]、AlphaLISA檢測方法[19]、QuEChERS法[20]等，快速濾過型凈化柱(multi-plug filtration cleanup，m-PFC)在傳統(tǒng) QuEChERS 方法之上進行優(yōu)化[21]，簡化前處理操作，利用新復(fù)合型納米材料，更大比表面積，分散性好等優(yōu)點，提高去除基質(zhì)中色素、有機酸、部分糖類、脂類、甾醇類等干擾物，完成基質(zhì)的凈化。與傳統(tǒng)方法相比，該方法不需要稱量N-丙基乙二胺、C18和無水硫酸鎂等吸附劑，無需活化淋洗洗脫程序，可實現(xiàn)一步凈化，從而大大縮短了凈化時間，可大幅度提高前處理的總體速率。目前該方法已成功應(yīng)用于人參[22]、生姜[23]、果蔬[24]、茶葉[25]等農(nóng)藥的多殘留檢測中，但尚未見用于水產(chǎn)品中藥物殘留的分析。本文采用m-PFC結(jié)合UPLC-MS/MS 檢測技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中MG及其代謝物MG、CV及其代謝物L(fēng)CV同時檢測的方法，旨在為簡單、快速檢測水產(chǎn)品中的藥物多殘留和藥物風(fēng)險評估提供思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，美國Waters公司；ME204E 分析天平，瑞士梅特勒-多利多儀器有限公司；渦輪振蕩器，德國IKA 公司；Milli-QA10超純水儀，美國Millipore公司；IKA T25高速組織勻漿機，飛利浦公司；高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；超聲波清洗器，瑞士BUCHI公司；移液器，Eppendorf 中國有限公司。

MG、LMG、CV、LCV、內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠(D5-MG)、內(nèi)標(biāo)氘代隱性孔雀石綠(D6-LMG)(6種標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%)，德國 Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇為色譜級，德國Merck公司；乙酸銨、甲酸為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純，中國Macklin公司；m-PFC專用凈化柱和陶瓷均質(zhì)子，北京綠綿科技有限公司；0.22微孔濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單標(biāo)儲備液：分別精密稱取MG、LMG、CV、LCV、D5-MG和D6-LMG標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于25 mL的棕色容量瓶中，用乙腈溶解定容配制成400 μg/mL的單標(biāo)儲備液，然后再用乙腈稀釋配成10 μg/mL的單標(biāo)中間液，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別精密吸取MG、LMG、CV、LCV單標(biāo)中間液1.00 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用乙腈定容后配成1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-20 ℃避光保存。

混合內(nèi)標(biāo)中間液：分別精密吸取氘代孔雀石綠和內(nèi)標(biāo)氘代隱性孔雀石綠單標(biāo)中間液1.00 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用乙腈定容后配成1.00 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)中間溶液，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，隨用隨配制，吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-5 mmol/L乙酸銨混合溶液(體積比1∶1)稀釋配制0.100、0.200、1.00、4.00和6.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為1 ng/mL，于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

樣品制備：用均質(zhì)器將500 g可食的鮮魚肉均質(zhì)后混勻，裝入干凈的容器中，用保鮮膜密封，保存于-20 ℃冰箱中冷凍備用。

樣品的提取：將樣品取出稍解凍，稱取勻漿樣品5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL 具塞離心管中，加入100 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)，依次加入 2.0 mL 超純水和 10.0 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸)，渦旋 1 min，再加入4.0 g MgSO4、1.0 g NaCl及1顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min；以8 000 r/min離心5 min，將全部上清液轉(zhuǎn)入空離心管中，冷凍除脂后，剩余提取液待凈化。

樣品的凈化：準(zhǔn)確移取上述提取液1 mL，從m-PFC凈化柱頂部加入，柱底端連接0.22 μm有機濾膜，濾膜下方連接進樣小瓶，然后緩慢推動注射桿，流速1～1.5 s/滴，棄去初濾液1～2滴，收集續(xù)濾液，即得待測液，待UPLC-MS/MS測定(圖1)。

圖1 樣品前處理流程圖Fig.1 The flow chart of the sample pretreatment

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相A為甲醇，流動相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)，流速：0.3 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣量：2 μL，梯度洗脫，具體流動相比例見表1。

1.有27顆珍珠，其中1顆是假的，但外觀和真的一樣，只是比真珍珠輕一點。請問，最少用天平稱幾次（不用砝碼）就可以把假珍珠找出來？

表1 液相色譜梯度洗脫方法Table 1 Gradient elution method of liquid chromatography

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描(electrospray ion source positive ion，ESI+)，霧化氣溫度：500 ℃，霧化氣流速1 000 L/h，毛細(xì)管電壓：0.4 kV，錐孔氣流速：150 L/h，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)。

1.5 定量計算

采用內(nèi)標(biāo)法測定MG和CV的峰面積，MG和CV的內(nèi)標(biāo)物為氘代孔雀石綠，LMG和LCV的內(nèi)標(biāo)物為氘代隱性孔雀石綠。

本方法中MG的殘留量是指MG和它的代謝物L(fēng)MG殘留量之和，以MG表示。

本方法中MG的殘留量是指MG及其的代謝物L(fēng)CV殘留量之和，以CV表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

與GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》的色譜條件對比，本文將乙腈更換為甲醇，因為實驗過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈的極性大于甲醇，在反相色譜柱中，化合物會延后出峰，并且堿性的4個MG類化合物都出現(xiàn)峰型變寬和拖尾的情況，因此，選擇乙酸銨作為緩沖溶液，可以調(diào)節(jié)pH值并促進目標(biāo)物生成正離子的情況下，加入甲酸，使pH<4，可以有效解決色譜柱游離硅羥基與堿性化合物的二級作用所造成的拖尾，從而獲得峰型對稱，靈敏度較高的峰(圖2)。

圖2 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg時4種標(biāo)準(zhǔn)品分別在優(yōu)化液相方法和國標(biāo)液相方法下的總離子流對比圖Fig.2 Comparison of total ion chromatograms of four standards under optimized liquid phase method and national standard liquid phase method at 0.5 μg/kg

將梯度洗脫流速設(shè)置為0.3 mL/min時，洗脫速度加快，3 min內(nèi)可將目標(biāo)物全部洗脫出來，分析時間短，有機試劑用量少，基線較穩(wěn)定，干擾少，化合物能夠有效分離，可以達(dá)到快速檢測的目的。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖3 六種標(biāo)準(zhǔn)物MRM離子流圖Fig.3 Standard ion chromatograms for multi-reaction monitoring of six standards

表2 質(zhì)譜參數(shù)表Table 2 Mass spectrometric parameters

2.3 樣品前處理條件優(yōu)化

使用m-PFC法凈化時，提取通常需要根據(jù)基質(zhì)的差異，決定是否選擇需要添加MgSO4進行脫水干燥以及使用氯化鈉加速水相與有機相的分層，同時需要選擇合適的m-PFC凈化柱，以促進基質(zhì)中多藥物殘留的充分溶出。本研究中，為了便于冷凍除脂，添加了無水硫酸鎂和氯化鈉，選擇吸附填料為新復(fù)合型納米材料的m-PFC小柱，對水產(chǎn)品的提取液進行凈化，獲得了理想的凈化效果。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)

ME普遍存在于藥物殘留分析中，是指基質(zhì)中一種或者多種成分對目標(biāo)物分析結(jié)果的影響。樣品基質(zhì)中的某些共提取物組分能明顯降低或增強目標(biāo)物離子的生成速率與強度，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其是在質(zhì)譜檢測中，基質(zhì)效應(yīng)很普遍。可以使用比值法來評價：ME=B/A，其中，A為純?nèi)軇┲兴幬锏捻憫?yīng)值，B為空白樣品基質(zhì)中添加相同含量藥物的響應(yīng)值。若比值>1，則視為基質(zhì)增強效應(yīng)，比值<1，則為基質(zhì)減弱效應(yīng)，比值=1，說明基質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)的測定沒有影響。

本研究在同一質(zhì)量濃度水平下，采用流動相和基質(zhì)空白分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過對4種物質(zhì)的響應(yīng)比值來獲得基質(zhì)效應(yīng)的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白基質(zhì)對MG、CV、LMG的峰響應(yīng)有較大抑制作用，基質(zhì)效應(yīng)的比值<1，而對LCV峰響應(yīng)幾乎無影響，基質(zhì)效應(yīng)的比值≈1(表3)。基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因復(fù)雜，難以根本清除。據(jù)報道，用來減少或補償基質(zhì)效應(yīng)的方法有：基質(zhì)凈化法、同位素內(nèi)標(biāo)法、空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液等[25]。使用同位素內(nèi)標(biāo)，可以有效地校正基質(zhì)效應(yīng)，但如果內(nèi)標(biāo)含量和分析物含量不一致，基質(zhì)效應(yīng)會有差異[26-27]。本研究為了能較好地降低ME的影響，采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和同位素內(nèi)標(biāo)2種方式進行校正。

表3 四種標(biāo)準(zhǔn)物的ME對比Table 3 Comparison of matrix effects of 4 standards

2.5 方法的線性范圍、檢出限和定量限

4種藥物在最佳條件下的總離子流圖見圖4。可見，在最佳條件下4種藥物的分離度良好，在5 min內(nèi)可完成4種藥物的基線分離。

圖4 四種標(biāo)準(zhǔn)物在1.00 ng/mL時的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of 4 standards at 1.00 ng/mL

由表4可知，4種藥物的線性范圍均在0.1～6.0 ng/mL，色譜峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。本實驗通過向草魚空白基質(zhì)中添加多個較低水平的藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進行試驗，所得溶液經(jīng)UPLC-MS/MS 分析，取各藥物的S/N=10時的質(zhì)量濃度計算該藥物的定量限，以S/N=3時相應(yīng)濃度確定檢出限。經(jīng)計算，4種藥物的檢出限均為0.05 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg。比標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限(0.5 μg/kg)降低近10倍，說明本方法有較高的靈敏度。

表4 四種化合物的線性范圍、檢出限和定量限以及加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Linear relationships, detection limits and quantitation limits, recoveries and RSD of 4 compounds

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-內(nèi)標(biāo)法定量，對水產(chǎn)品羅非魚、草魚中空白樣品進行添加回收試驗，添加水平分別為0.5、1、2、10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)6次，低速渦旋后加蓋密封，冷藏過夜，第2天取出后置于通風(fēng)櫥避光放至常溫，加入內(nèi)標(biāo)后靜置2 h，之后按照本文樣品的前處理方法進行提取凈化。由表4可知，在不同的添加水平下，該方法的回收率為71.1%～84%，RSD為 9%～14%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，精密度良好，能夠滿足檢測要求。

2.7 m-PFC方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

以水產(chǎn)品樣品為例，當(dāng)添加水平為2 μg/kg時，分別采用m-PFC方法和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》對4種藥物的回收率進行了檢測。結(jié)果顯示，采用m-PFC法，4種藥物的回收率為71.5%～85%，RSD<11%；采用標(biāo)準(zhǔn)方法，4種藥物的回收率為78%～104%，RSD<8%。2種方法相比，回收率相差較小，準(zhǔn)確度也均符合要求，但是標(biāo)準(zhǔn)方法前處理過程包括液液分配至二氯甲烷層進行提取，中性氧化鋁柱和陽離子固相柱的凈化以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮等過程，步驟繁瑣、費時費力，有毒試劑消耗量大等[28]。而本方法中樣品直接用乙腈振蕩提取，高速離心，冷凍除脂后，將上清液直接注入m-PFC小柱凈化，凈化一步完成，直接吸附雜質(zhì)，無需活化淋洗洗脫，試劑用量少，無需濃縮，單個樣品凈化時間小于1 min。相比標(biāo)準(zhǔn)方法，具有步驟簡單，省時省力、靈敏度高的優(yōu)點，在保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的前提下大大提升了檢測效率，完全滿足實驗室檢測的要求。

2.8 實際樣品檢測結(jié)果

以本研究所建立的m-PFC凈化結(jié)合UPLC-MS/MS法，對市售的草魚、羅非魚、鰱魚共3份水產(chǎn)品樣品中的4種藥物進行檢測，結(jié)果均為未檢出，與國標(biāo)方法測定的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究采用m-PFC前處理凈化技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS法，建立了水產(chǎn)品中MG及其代謝物L(fēng)MG、CV及其代謝物L(fēng)CV同時檢測的分析方法。該方法單個樣品凈化時間<1 min，整個樣品的前處理及分析時間能夠在30 min內(nèi)完成。4種藥物的線性范圍在0.1～6.0 ng/mL，檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg，其檢出限較GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》的檢出限值 (0.5 μg/kg) 降低近10倍。在 0.5、1、2、10 μg/kg 這4個添加水平下，方法平均回收率均在 71.1%～84%，RSD均小于14%，回收率較好且方法穩(wěn)定。與傳統(tǒng)前處理方法相比，所建立的方法具有操作簡單、省時省力、靈敏度高，在保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的前提下大大提升了檢測效率，為孔雀石綠及其結(jié)晶紫在水產(chǎn)品中的殘留測定提供了一種有效的技術(shù)支撐，同時為研發(fā)建立更快速、準(zhǔn)確地檢測水產(chǎn)品中藥物殘留的方法提供了新思路。