綿羊胚胎移植技術關鍵步驟優化*

晁旭東，李 軍，劉長彬，李守江，谷紅偉，王智鵬，郭延華.，倪建宏，王 萌

（1.佛山守仁生物技術有限公司，廣東 佛山 528000；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國建重點實驗室）

胚胎移植（Embryo Transfer）亦稱“借腹懷胎”，即選擇優良的種畜，超數排卵后人工授精，在授精后的第6天，采取手術法沖胚，獲得桑椹胚、囊胚或擴張囊胚等早期胚胎，移植于相同物種同一生理狀態的母畜子宮內，使之妊娠并發育為另一新生命體的過程[1]。胚胎移植技術是試管嬰兒、體外受精、轉基因、體細胞核移植等的基礎性環節。所以，胚胎生物工程技術又被譽為繁殖技術的第二次生物技術革命，其發展歷程已有100多年的歷程。1890年英國劍橋大學的Heape，在安哥拉兔上取得了胚胎移植的成果，奠定了胚胎移植的生物學基礎。隨著研究的不斷深入，人們不斷在超排方案、藥品選擇和同期發情程序等方面展開研究，并著重在實踐中應用[2]。1990年美國胚胎移植普及率為27.5%，種畜為44%，經濟效益超過了650億美元。美國、法國等每年參加測定的青年公牛80%為胚胎移植牛[3]。截止目前，胚胎移植已發展到分割胚、嵌合體、轉基因胚、核移植胚、性別鑒定以及制造生物反應器等，胚胎移植研究領域以及在應用實踐上的價值巨大[4-9]。

我國胚胎移植技術起步較晚，但發展速度驚人，1974—1994年20年間完成了引進、學習、消化和吸收、到再創新的階段。1994—2014年間完成了胚胎移植技術由實驗室走出來，開始服務于畜牧業生產，胚胎移植技術在種畜養殖場的應用，已經成為畜牧業發展中最具有價值和生機的應用技術之一[10-13]。

本試驗對胚胎移植系統工程中供體挑選、FSH超數排卵、沖胚管放置位置和氣球大小、子宮角牽出和打孔等關鍵技術環節進行進一步深入研究，通過對這些關鍵環節的完善，在胚胎移植的獲胚率和移植受胎率上有了明顯提升（P＜0.05）。

1 材料與方法

1.1 試驗羊的選擇與分組

隨機選擇健康、無繁殖疾病、具有產羔經歷、膘情在2.5～3.0分的薩?？巳庋?，隨機分組。共選擇供體母羊86只，受體母羊115只。所選羊只舍飼，自動飲水機飲水。公羊選擇本地體質健壯、性欲旺盛、精液質量優良的成年羊，按1∶25的比例做試情公羊。

1.2 試驗藥品與材料

CIDR栓（燕瑞生物科技有限公司）、FSH（寧波三生藥業有限公司）、PMSG（寧波三生藥業有限公司）、PGF2a（上海計劃生育研究所、寧波三生藥業有限公司）、8號沖胚管（進口）；生理鹽水、酒精、碘酒、噴壺、套管針、青霉素、新潔爾滅等均為國產；開膣器、輸精槍、1 mL注射器、水浴鍋、顯微鏡。

1.3 實施時間及應用地點

于2019年4月至2020年12月在喀什、克拉瑪依、和第八師一四五團開展相關試驗。

1.4 胚胎采集

采用羊用沖胚管（8號管）從子宮體打孔插入相對應的子宮一側，然后氣球打氣，氣球打氣量一般在3～5 mL為宜，固定好位置后，向子宮內注入PBS液至子宮充滿，然后從宮管結合部，迅速插入套管針，將沖胚液引流至培養皿（100 mm），沖胚結束后將培養皿送至實驗室撿胚胎，并做胚胎質量鑒定。

1.5 供體羊營養狀況

在整個處理期，保持供體羊的飼養水平均衡，切勿更換飼料。在撤栓時頸部肌肉注射維生素ADE液。

1.6 數據處理

用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，經t檢驗評估不同組之間的差異。

2 結果與分析

2.1 供體羊體況對超排效果和胚胎質量的影響

在同一飼養管理和同一品種的情況下，按照羊體況評分（參照奶牛評分標準），分值為1～5分，當體況評分在2.5～3.0分時，超數排卵效果較4.0分以上效果好，且差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1 供體羊體況對超數排卵和胚胎質量的影響

2.2 超排藥物對獲胚數的影響

在本試驗中，選擇不同的超排藥物組合，取得了不一樣的超排結果，且兩組數據之間差異顯著（P＜0.05），100 IU/支組平均獲得的胚胎數高于500 IU/支組，見表2。

表2 超排藥物組合對獲胚胎數的影響

2.3 沖胚管在子宮角內放置位置與獲胚數的關系

對沖胚管氣球放置在子宮角內的位置對獲胚胎數的影響，以及子宮角大彎前段與子宮角大灣段平均獲胚胎數的關系進行研究，結果顯示，沖胚管氣球放置在子宮角大彎前段獲胚數優于子宮角大灣段，且差異明顯（P＜0.05），見表3。

表3 沖胚管子宮角內不同放置位置對獲胚數的影響

2.4 胚胎移植時子宮角打孔出血率與受胎率的關系

胚胎在移植時，需要在子宮角小彎處打孔，前期研究者一般使用回形針打孔，打孔后子宮角打孔部位出血明顯，本研究中使用了子宮角打孔器（專利號：ZL 2015 2 0272750.4）打孔，子宮角打孔部位出血現象極顯著減少（P＜0.01）。因為出血比例的降低，受胎率顯著提高（P＜0.05），見表4。

表4 子宮角不同打孔方式出血率與受胎率

3 討論

本研究從體況評分、超排方法、沖胚管放置位置和子宮角打孔等方面對綿羊胚胎移植影響因素進行了試驗與分析。研究表明，體況評分在2.5～3.0分之間的供體羊獲得的可用胚胎數高于評分為4.0分的供體羊，且差異顯著（P＜0.05）。不同超排藥物組之間也存在顯著性差異（P＜0.05）。沖胚管氣球在子宮內所在位置對獲得胚胎數方面存在顯著性差異，本研究對氣球放在子宮角大彎處和大灣前所獲得的胚胎數進行了對比，從研究數據可以看出，氣球放在子宮角大彎前獲得的胚胎數多于子宮角大彎處，且差異顯著（P＜0.05），除此之外，在對供體進行沖胚操作時，應根據子宮的體積大小、子宮角長短和子宮角粗細等因素來綜合判定沖胚管氣球所處的位置，只有通過綜合判斷，恰當放置沖胚管氣球位置才能取得較好的沖胚效果。最后，還研究了鈍性（曲別針）打孔和打孔器打孔對受胎率的影響，通過分組數據可以看出，采用鈍性（曲別針）打孔，子宮角出血率較高，達到83.93%，而采用打孔器打孔，出血率僅為8.41%，差異極顯著（P＜0.01）。子宮角打孔出血直接影響移植受胎率，從試驗數據可以看出，子宮角打孔器打孔獲得受胎率極顯著高于鈍性（曲別針）打孔（P＜0.01）。