水母生物毒素提取純化及其生物活性研究進展

吳金輝，呂 喆，張重陽*，劉志亮，杜 彬*，楊越冬*

(1 河北省天然產物活性成分與功能重點實驗室，河北 秦皇島， 066004；2 秦皇島市第一醫院急診科；3 河北科技師范學院海洋科學研究中心)

水母屬于刺胞動物門，缽水母綱，是刺胞動物的代表物種[1]。刺細胞是刺胞動物所特有的1種攻擊和防衛性細胞，每個刺細胞均有1種特殊的細胞器——刺絲囊[2，3]，不同體積和形態的刺絲囊可能儲存不同生物活性的毒液，囊中有毒液和盤繞的刺絲，刺細胞外側有刺針，受到物理或化學刺激時，刺絲以及毒液隨著刺針立即射出，蟄傷對方，水母從而捕食獵物或保護自己[4，5]。人類皮膚被蟄傷后常見的癥狀為皮膚炎癥反應如紅腫、瘙癢等，嚴重者會導致全身中毒反應甚至死亡[6～8]。水母中除了含有毒素之外，還含有多種生物活性物質，如多糖[9], 膠原蛋白肽[10，11]等。

水母生物毒素具有廣泛的生物活性，比如抗氧化，治療心血管疾病、糖尿病和抗癌等[12～16]。但是關于水母生物毒素的一些關鍵科學問題尚未搞清楚，如高效提取方法、高效純化技術、毒素的本質、毒素蛋白的種類、毒素的活性、毒素作用機理等[17～21]。因此，從水母中提取毒素，純化出高生物活性毒素是水母毒素領域研究的關鍵。筆者對近些年有關水母生物毒素的文獻進行系統的綜述，主要側重水母生物毒素的提取制備、分離純化和生物活性，旨在為水母生物毒素的復雜分子機制提供理論依據和技術支持，為治療水母蜇傷和進一步開發新型海洋天然藥物提供科學依據。

1 提取制備方法

1.1 觸手直接破碎提取法

儲存水母毒素的刺細胞主要生長在水母觸手上，于是，在認知較淺，儀器短缺的早期研究中，直接碾碎水母觸手來提取粗毒，再研究粗毒的毒性，是當時較適合的提取方法，此法為人類研究水母毒素邁出了第一步。但是，此法導致提取的粗毒中雜質太多，過多的雜質使毒素純化困難，從而無法深入研究毒素活性和作用機制等關鍵問題，所以現在幾乎不再使用此法[20]。

1.2 刺絲囊破碎提取法

刺絲囊是1種刺細胞內特殊細胞器，是水母唯一能夠儲存毒液的細胞器。刺絲囊破碎提取法是目前應用最廣的水母毒素提取方法，即通過水母觸手自溶，刺絲囊脫落，再將刺絲囊分離收集，再進行破碎，從而提取雜質明顯更少的毒素的方法。破碎刺絲囊的方法包括：超聲波破碎法，研缽破碎法，組織研磨器破碎法等。相比觸手直接破碎提取法，此方法避免了觸手雜質的干擾，優化了提取的效率，有利于毒液純化和研究毒素本質，以及深入研究不同毒素活性。但是，此法仍存在刺絲囊雜質干擾，破碎刺絲囊過程中易產熱影響毒素活性等問題。

不同體積形態的水母刺絲囊可能含有不同的有毒成分。Wang等[22]改進了以往的方法制備不同體積形態的刺絲囊，通過自溶觸手分離刺絲囊，刺絲囊在不連續梯度percoll細胞分離液中離心，將不同體積形態的刺絲囊分離，然后去除Percoll細胞分離液，收集不同體積形態的刺絲囊，保存在-80 ℃用于后續提取不同毒液。這種改進的分離刺絲囊的方法雖然對減少雜質幫助不大，但是對于從刺絲囊提取毒素的純化影響深遠，同一水母不同刺絲囊的毒素差別不大，提取的所有刺絲囊共同破碎取得的毒液必然難以純化，于是這種先分離不同類型刺絲囊，然后再分別提取毒液的方法就有了極大的研究和應用意義。

1.3 超低溫刺激刺絲囊提取法

低效率的傳統分離和純化方法妨礙了從水母中大規模鑒定新毒素和生物活性成分[23]。超低溫刺激刺絲囊提取法是采用-80 ℃的超低溫冷凍水母觸手，刺激刺絲囊釋放毒液。此法無需破壞刺絲囊，減少了雜質混入，而且操作在低溫下進行，有利于保持毒素活性，為水母毒素進一步純化和活性研究奠定了基礎。

薛偉等[24]改進了白色霞水母毒素提取方法，采用超低溫冷凍水母觸手，刺激刺絲囊釋放毒液，得到粗毒，然后通過陰離子交換層析(DEAE Sepharose)和凝膠過濾層析(SephadexG-200)最終分離純化得到分子量為45 ku的毒素蛋白。此法為難以分離刺絲囊的水母和提取極其不耐熱的水母毒素提供了一個新思路。

1.4 劇烈機械震蕩刺激刺絲囊提取法

劇烈機械震蕩刺激刺絲囊提取法采用劇烈機械震蕩處理水母觸手，通過物理法刺激刺絲囊釋放毒液，得到水母生物毒素粗毒。常銀龍[25]通過劇烈機械震蕩刺激刺絲囊，使大部分刺絲囊釋放毒液，簡便地得到了水母毒液。該方法也不會破壞刺絲囊細胞，減少了雜質的混入，操作較簡便，適合于產量較低的粗毒提取制備階段。但是毒液純化依舊很困難，難以純化的毒液是鑒定毒素成分和生物活性的首要問題。

1.5 乙醇刺激刺絲囊提取法

由于從刺絲囊中提取足量毒素的技術存在困難，水母生物毒素的研究一直落后于其他毒理學領域。Mahdokht等[26]報道了一種新型的快速、有效、可重復的水母毒素制備方法，即用乙醇誘導刺絲囊排出毒液，一步回收毒素。以乙醇刺激刺絲囊釋放毒素，再以乙醇作為提取溶劑來提取水母毒素，與傳統方法——外力直接破碎刺絲囊或觸手提取毒素法相比，刺絲囊細胞未受到破壞，毒素完整性得以保存，混入蛋白質雜質減少，操作便捷，乙醇可重復使用，實驗成本低，為水母毒素進一步分離純化、結構鑒定和活性研究奠定了基礎。

但是，乙醇刺激刺絲囊提取法也有其缺點。Cantoni等[27]比較了鹽水提取方法和體外化學誘導釋放毒素2種技術。大小排斥層析顯示，2種方法的毒液圖譜有明顯差異：鹽水回收法的FPLC圖譜和SDS-PAGE凝膠與以前發表的結果相似，而乙醇誘導的方法則不同。SDS-PAGE凝膠顯示鹽水法回收的先前鑒定的心臟毒性蛋白有明顯的40～55 ku條帶，而乙醇誘導的方法則產生降解的毒蛋白條帶。通過xCELLigence實時細胞分析(RTCA)產生的濃度-反應曲線顯示，當通過鹽水排放恢復的毒液作用于這些細胞時，人心肌細胞的活性急劇下降。除1個樣本外，所有乙醇誘導的回收毒液在應用于人心肌細胞時均不能引起細胞存活率的濃度依賴性下降，導致比較的毒液樣本之間的IC50有顯著差異。此研究有助于更好地理解在未來水母毒素提取研究中開發和利用新技術所必需的參數和分析，與鹽水降解觸手和組織研磨器提取毒液的方法相比，乙醇刺激刺絲囊提取方法具有一定的局限性。水母生物毒素的不同提取制備方法以及優缺點見表1。

表1 水母毒素的提取制備方法及其優缺點

2 分離純化方法

水母生物毒素的主要成分是蛋白質和多肽，因此水母毒素的分離純化大多采用蛋白質分離純化手段。根據蛋白質分子性質不同，用于水母生物毒素分離純化的方法主要有：凝膠過濾層析，蛋白質鹽析分離，離子交換層析，親和層析，高效液相層析，快速蛋白液相層析等。

Bae等[28]采用DEAE陽離子交換柱分離得到沙海蜇中具有纖溶活性的毒素成分，分子量約為70，35，30和28 ku，這些毒素被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟完全阻斷，所以這些毒素可以判斷是具有纖溶活性的類糜蛋白酶絲氨酸蛋白酶。這些信息可能有助于開發水母環境的臨床管理和未來治療血栓性疾病的藥物。

Fraz?o等[29]利用1D SDS-PAGE和2DE對夜光游水母體蛋白質進行分離，然后利用納米LC-MS/MS和MALDI-TOF/TOF技術對其進行表征。2種方法共檢測出68種不同的蛋白質，首次鑒定得到1種鋅金屬蛋白酶、1種紅色熒光蛋白(RFP)和1種過氧化物酶，其中鋅金屬蛋白酶具有ShK毒素結構域，與夜光游水母的蜇傷毒性作用有關。

Choudhary等[30]探索了一種蛋白質組學方法來鑒定沙海蜇成分及其與水母蜇傷引起的病理效應的相互關系。Choudhary利用二維凝膠電泳和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI/TOF/MS)技術，共鑒定出150種蛋白質。這為理解沙海蜇毒液中毒機制提供了重要的信息，為新的蛋白質發現和開發處理水母蜇傷人類的實用方法提供理論支持。

3 生物活性研究

水母生物毒素一般對人體產生神經毒性、溶血性、心臟毒性、皮膚肌肉毒性等[32]；但在特定條件下，也具有友好醫學生物活性，比如抗菌、止痛、抗凝血、抗氧化和抗腫瘤等[33]。

3.1 友好生物活性

3.1.1酶活性 Yue等[34]通過生物化學和動力學分析了沙海蜇和白色霞水母毒素的酶學性質。結果顯示，毒素表現出多種酶活性，其中金屬蛋白酶活性和類PLA2s活性占主導。金屬蛋白酶和類似PLA2s的催化活性取決于不同的物理化學條件，如溫度，pH和二價離子。動力學分析表明，它們在特定條件下的催化行為符合Michaelis-Menten方程。水母刺絲囊毒素具有多種酶促成分，這可能是水母生物毒素具有廣泛特征的生物活性的基礎。該研究將有助于理解水母刺絲囊毒素的酶促成分和毒性，并可能為開發用于水母蟄傷的藥物提供潛在的治療靶標。

3.1.2抗氧化性 Fraz?o等[29]利用1D SDS-PAGE和2DE對夜光游水母體蛋白質進行分離，然后利用納米LC-MS/MS和MALDI-TOF/TOF技術對其進行表征。在夜光游水母毒液中鑒定出1種過氧化物酶，具有較強的抗氧化和抗紫外線輻射能力，使其成為抗氧化劑和抗紫外線輻射劑的新的自然資源。

3.1.3纖溶活性 Bae等[28]采用金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑進行纖維蛋白譜分析，研究沙海蜇的絲狀蛋白酶及其組成特征，探討沙海蜇的纖溶活性與絲氨酸蛋白酶活性的關系。結果顯示：沙海蜇毒素具有纖溶活性，分子量約為70，35，30，28 ku，主要表現為糜蛋白酶樣特征。在低pH(<6)和高溫(>37 ℃)下，其活性完全消失。部分金屬離子(Co2+，Cu2+，Zn2+，Ni2+)對其纖溶活性有較強的抑制作用，而Ca2+和Mg2+則沒有抑制作用。沙海蜇毒素中含有一種具有纖溶活性的糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，這些信息可能有助于開發水母環境的臨床管理和未來治療血栓性疾病的藥物。

3.1.4抗凝血活性 Rastogi等[35]從印度桶狀水母觸手提取物中分離水母毒素，并研究其抗凝血活性。結果表明，該毒素顯示出纖維蛋白原分解特性，對ADP誘導的血小板聚集的抑制作用。觸手提取物還對人的RBC具有顯著的溶血活性，對(偶氮)酪蛋白和明膠等底物也具有很強的蛋白水解活性。但是，這種蛋白水解活性完全被金屬蛋白酶抑制劑(EDTA)抑制，而未被絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)抑制。

3.1.5抗癌性 Ha等[36]以慢性粒細胞白血病K562細胞為研究對象，以正己烷刺激水母刺絲囊釋放毒液，研究沙海蜇正己烷提取的毒液的體外抗癌作用機制，發現毒液對慢性粒細胞白血病K562細胞具有抗癌作用。水母正己烷提取毒液的抗癌活性可能是通過誘導K562細胞中caspases和MAPK的激活，特別是p38的磷酸化，使細胞周期阻滯在GO/G1期而產生介導。該研究填補了水母毒素抗癌活性的空白，為探究海洋生物資源治療癌癥的作用機制和藥物研究奠定了理論基礎。

Pang等[37]通過A431人表皮癌細胞研究了白色霞水母和沙海蜇刺絲囊粗毒素的細胞毒活性。結果表明，在24 h孵育后，2種水母生物毒素的IC50分別為68.6，40.9 mg/L，來自霞水母的毒液顯示出比沙海蜇更強的細胞毒活性。

Morabito等[38]研究發現哺乳動物細胞暴露在夜光游水母刺絲囊毒素中，會顯著地改變細胞質膜的離子電導，從而影響細胞體積的調節和維持等穩態功能。毒液誘導的NaCl內流，然后是水和細胞腫脹，很可能是夜光游水母生物毒素殺傷細胞活性的基礎。該研究強調了夜光游水母毒液的獨特性質，并為其活性化合物的可能用途和毒液中毒的治療方法提供了必要的信息。

3.2 非友好生物活性

3.2.1腎臟毒性 Li等[39]通過急性毒理學方法和病理學分析，探討了沙海蜇生物毒素的體內毒性。采用靜脈注射，該毒液在小鼠體內的LD50約為2.92 mg/g(按小鼠體質量計)，并引起腎小球腫脹、腎小泡狹窄、腎小管擴張、肝血竇擴張、肺水腫和惡性胸腔積液。病理切片分析顯示腎臟和肝臟明顯受損，但心、脾、胃未見明顯改變。此外，注射毒液后，小鼠還表現出抽搐，口腔出血，豎毛，呼吸困難和死亡。該毒素對小鼠腎臟有很強的毒性，急性腎功能衰竭可能是嚴重蜇傷后死亡的最重要因素之一。

3.2.3致炎性 抑制炎癥反應是治療水母蜇傷的關鍵，探索水母生物毒素中引起炎癥反應的主要成分是一個亟待研究的領域。Li等[41]從細胞水平探討了基質金屬蛋白酶抑制劑對毒液誘發的炎癥的抑制作用。以沙海蜇刺絲囊毒液抑制劑治療后，在人角質化細胞和人類胚胎皮膚成纖維細胞2種皮膚細胞系中，3種炎癥因子IL-6，MCP-1和TNF-α被確定。結果表明，基質金屬蛋白酶抑制劑能顯著降低沙海蜇刺絲囊毒液對皮膚細胞的毒性作用。IL-6，MCP-1和TNF-α在細胞內的表達水平也明顯降低，這表明基質金屬蛋白酶可能是導致水母皮炎的重要因素。本研究對水母蜇傷的預防和治療有一定的參考價值。

Bruschetta等[42]驗證夜光游水母生物毒素是否能誘發大鼠體內的炎癥和氧化應激反應。在第一組實驗中，給動物注射粗毒液(以6，30，60 μg/kg等3種不同劑量，懸浮在鹽溶液中，靜脈注射)，以測試死亡率和可能的血壓變化。在第二組實驗中，為了證實夜光游水母粗毒能促進ROS的形成，并可能有助于炎癥的病理生理學，注射粗毒液的動物(30 μg/kg)也用強抗氧化劑四甲基哌啶(100 mg/kg，注射粗毒液后30，60 min)進行處理。注射粗毒液后，四甲基哌啶導致與炎癥相關的各項參數顯著降低。結果證實夜光游水母毒素在全身炎癥過程中的潛在作用，增加了關于其生物活性的新信息。四甲基哌啶通過抑制NF-κB p65阻止了抗凋亡途徑的喪失，并減少了促凋亡途徑的激活。

3.2.4溶血活性 Yue等[43]采用凝膠內酶譜和液相色譜串聯質譜相結合的方法對沙海蜇酶毒素進行功能鑒定，利用特異性抑制劑研究了金屬蛋白酶和脂肪酶在溶血活性中的潛在作用。結果表明，刺絲囊毒素具有蛋白酶、脂肪酶和透明質酸酶類活性。液相色譜串聯質譜的蛋白質組學方法結果顯示，酶譜中觀察到的蛋白水解帶與現存的鋅金屬蛋白酶裂解酶和蝦紅素金屬蛋白酶具有序列同源性。與暴露于毒液的綿羊紅細胞相比，金屬蛋白酶抑制劑巴馬司他與沙海蜇刺絲囊毒液預孵育后，溶血率降低了約62%，這表明金屬蛋白酶有助于溶血活性。此外，在凝膠覆蓋試驗中，分子量在14～18 ku范圍內的毒素表現出卵黃和紅細胞溶解活性。該研究首次證實了水母毒素金屬蛋白酶的作用，并提示脂肪酶參與了溶血活性。對這種關系的研究將有助于更好地了解水母毒素的成分和毒性。

Pang等[37]發現白色霞水母和沙海蜇刺絲囊中粗毒液具有溶血活性。與沙海蜇相同長度的觸角相比，白色霞水母觸角上的刺絲囊數量更多。從沙海蜇提取的每個刺絲囊中的蛋白質濃度均高于白色霞水母的蛋白質濃度。2種刺絲囊毒液均對雞、鴿子和綿羊的紅細胞顯示出劑量和時間依賴性的溶血活性，其中綿羊的紅細胞最敏感，在暴露于沙海蜇的30 min后，EC50為69.69，63.62 mg/L。

Brinkman等[44]采用綿羊紅細胞溶血作為細胞溶解活性的指標，分離了澳大利亞箱形水母中2種主要的溶血素，其分子量分別為370和145 ku，以及一種較小的溶血素(約70 ku)。SDS-PAGE和蛋白質印跡蛋白圖譜表明370 ku溶血素由CfTX-1和CfTX-2亞基組成(分別約為43 ku和45 ku)[44]。

3.2.5致命性 水母毒液由多種毒素組成，而致命毒素是水母毒液中毒性最強、最危險的成分，是水母蜇傷和中毒致人死亡的主要原因。Li等[45]采用毒理學分析、蛋白質組分析和純化相結合的方法研究了霞水母生物毒素的致命性。結果顯示，心臟中毒包括急性心肌梗死，心率和血壓的顯著下降。共鑒定出316和374個同源蛋白，包括磷脂酶A2樣毒素和金屬蛋白酶毒素。此外，還證實了水母毒素的致命性與金屬蛋白酶活性有關，而與磷脂酶A2活性和溶血活性無關。綜上所述，該研究不僅為了解水母毒液的致命性機制提供了全面的信息，也為嚴重水母蜇傷的治療或搶救策略提供了非常有用的信息。

以前研究在沙海蜇毒液中發現了數百種毒素，但是目前還不清楚哪種毒素是致命的。Li 等[46]采用HiLoad 16/10SP Sepharose High Performance陽離子交換層析法和HiLoad 16/60Superdex 75體積排斥層析法結合使用的多重層析法，從沙海蜇毒液中分離出致命組分。致命組分對小鼠有較強的致命性，毒理學結果與沙海蜇蟄傷后死亡患者的臨床癥狀相一致，表明致命組分含有毒液中的關鍵致命毒素。此研究促進了人們對水母毒液致命性的認識，為治療水母蟄傷提供了理論依據，對今后治療這種水母蟄傷的藥物開發具有重要意義。

3.2.6心臟毒性 Chaousis等[47]首次發現了箱形水母中3種不同的生物毒素粗組分。通過基于阻抗的測定法監測人類肌肉細胞的生存能力，采用細胞增殖測定法測量其細胞毒性，得出細胞毒性與細胞代謝的減少相關。比較毒素成分對人心肌細胞和人骨骼肌細胞的影響，結果發現，2種組分特異性地影響具有不同時間特征的心肌細胞(CTF-a和CTF-b)。與CTF-b相比，CTF-a在較低濃度時活性增強，可引起快速但短期的細胞脫離和細胞代謝降低。這種活性不是永久性的，當暴露于除CTF-a測試的最高濃度之外的所有濃度時，觀察到細胞再附著和隨后的心肌細胞代謝增加。與CTF-a相比，CTF-b對細胞的細胞毒性作用時間是后者的2倍，這種活性具有永久性。此外，2種組分的組合具有協同效應，比每種毒素的單獨效應的總和更強和更快地導致細胞分離或死亡。

4 研究展望

氣候變化、食品和飲用水安全、商業驅動和技術發展是影響毒素學的四個重要的方面。然而，對于水母生物毒素研究，目前尚不清楚存在多少種毒素以及什么類型的毒素，另外，臨床癥狀與毒素之間的關系也不明確。在今后的研究中，增加鑒定毒素的數量和類型變得至關重要。此外，改良的組學技術可以從基因組或毒液中鑒定毒素，有助于鑒定新的天然分子，這些分子將會成為更有效的藥物先導化合物?？傊?，考慮到水母生物毒素的雙重生物活性，具有結合親和力和出色靶標特異性的生物毒素可以成為基礎細胞科學和醫學的有力工具。