新疆野蘋果抗寒生理生化機制研究

張 博，劉立強，秦 偉，烏仁其米格

（新疆農業大學 a.資環學院；b.園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆野蘋果Malus sieversii（Ledeb）M.Roem是薔薇科Rosaceae蘋果屬Malus植物，屬于瀕危二級重點保護植物[1]，也是蘋果遺傳育種中的優良抗逆種質資源[2]，國內主要分布在新疆伊犁河谷地區和準葛爾盆地西部，具有抗寒、抗旱、耐病蟲和耐鹽堿等優良抗逆性狀[3]。有關蘋果抗寒生理的研究報道很多：劉興祿等[4]在對蘋果抗寒砧木的研究中發現，抗寒性強的砧木品種能保持較高的酶活性；閆忠業等[5]比較分析低溫下不同品種蘋果的生理指標后發現，抗寒品種蘋果枝條中的MDA含量低且較穩定、POD活性高、脯氨酸含量穩定；王賀等[6]在對蘋果的研究中發現，低溫下SOD和POD活性，抗寒性弱的品種低于抗寒性強的品種；邵靜等[7]的研究結果表明，可溶性糖含量能夠反映出蘋果枝條受到低溫脅迫，1—5月不同時期蘋果1年生枝條中的可溶性糖含量與環境溫差呈正相關，而與環境溫度呈負相關；王飛雪[8]在對自然越冬的蘋果砧木實生后代枝條生理指標的研究中發現，其枝條中的保護酶活性隨著溫度的降低而增強，而其可溶性蛋白、可溶性糖、MDA的含量卻隨著溫度的降低均增大；閆娟娟等[1]在對新疆野蘋果28個種下類型葉片解剖結構的研究中發現，小黃酸野蘋果的葉片厚度、表皮厚度均最大，其柵欄組織和海綿組織均發達，而香酸野蘋果的葉片厚度與柵海比均最小，對其各形態指標的綜合評價結果表明，小黃酸野蘋果的抗寒性顯著強于香酸野蘋果的抗寒性。然而，關于新疆野蘋果抗寒性強的生理機制的研究報道少見。為給新疆野蘋果抗寒性表達的生理機制研究提供理論依據，本研究在前人[1]研究的基礎上，分別選用抗寒性相對強的小黃酸野蘋果和抗寒性相對弱的香酸野蘋果作為研究對象，對其1年生枝條各項抗寒生理指標進行了測定與分析，確定與新疆野蘋果抗寒性緊密相關的生理學指標，以揭示新疆野蘋果抗寒性強的生理機制。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選取原生境中抗寒性相對強的小黃酸野蘋果Malus sieversiif.luteolusD.F.Cui et L.Wang forma nov.和抗寒性相對弱的香酸野蘋果Malus sieversif.aromaticusD.F.Cui et L.Wang forma nov.，以引種資源圃中相同種下類型的小黃酸野蘋果M.sieversiif.luteolusD.F.Cui et L.Wang forma nov.和香酸野蘋果M.sieversif.aromaticusD.F.Cui et L.Wang forma nov.作為對照。

1.2 取樣的時間與地點和試材的采集

分別于2020年的10月8日、12月24日和2021年的3月28日即新疆野蘋果處于其自然越冬過程中的休眠前期、休眠期、解除休眠期進行采樣。生長于原生境中的供試材料其采樣地點分別為霍城縣大西溝鄉野果林（東經80°46′42.00′′，北緯44°25′51.95′′）、鞏留縣庫爾德寧鎮大莫乎鄉小莫乎溝野果林（東經82°47′53.28′′，北 緯43°11′56.16′′），生長于引種資源圃中的供試材料其采樣地點為伊犁哈薩克自治州農業科學研究所資源圃（東經81°23′15.00′′，北緯43°55′55.4′′）。

每個采樣地點選取1棵定點采樣樹，每個時期采樣分別選取定點采樣樹的東、南、西、北這4個方位、生長均勻健壯且無病蟲害的1年生枝條共40枝為試驗材料，用濕潤的無紡布將所采集的枝條樣品包裹好，放入恒溫箱帶回實驗室，以備相關生理指標測定之用。

1.3 測定指標與測定方法

采用電導法測定膜透性[9]；采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；采用茚三酮顯色法測定脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛含量；采用愈瘡木酚法測定過氧化物酶的活性，采用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶活性[10]。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2019軟件進行初步的數據處理，采用SPSS 26.0軟件進行顯著性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的電導率的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條的電導率見表1。由表1可知，在原生境中，休眠前期的相對電導率，小黃酸野蘋果的為0.27，香酸野蘋果的為0.33，前者顯著低于后者（P＜0.05）；休眠期與解除休眠期的相對電導率，小黃酸野蘋果的分別為0.28和0.37，香酸野蘋果的分別為0.32和0.39，前者均低于后者，但其差異均不顯著（P＞0.05）。在引種資源圃中，休眠前期的相對電導率，小黃酸野蘋果的為0.27，香酸野蘋果的為0.34，前者亦顯著低于后者（P＜0.05）；休眠期與解除休眠期的相對電導率，小黃酸野蘋果的分別為0.28和0.37，香酸野蘋果的分別為0.31和0.38，前者均低于后者，但其差異也都不顯著（P＞0.05）。比較分析可知，無論是在原生境中還是在引種資源圃中，小黃酸野蘋果在休眠前期的相對電導率均顯著低于香酸野蘋果在休眠前期的相對電導率，但其在休眠期和解除休眠期的相對電導率均無顯著差異。

表1 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條的電導率的差異分析結果?Table 1 Analysis results of the electrical conductivity difference of branches in different dormancy periods of M.sieversii f.luteolus and M.sieversii f.aromaticus

2.2 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的可溶性蛋白含量的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條中的可溶性蛋白含量見表2。由表2可知，在原生境中，休眠前期、休眠期和解除休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量均無顯著差異（P＞0.05）；進入休眠期后，小黃酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量增加了0.91 mg/g，香酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量增加了0.66 mg/g，前者明顯高于后者。在引種資源圃中，休眠前期與休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量均無顯著差異（P＞0.05）；進入休眠期后，小黃酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量增加了0.56 mg/g，香酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量增加了0.25 mg/g，前者明顯高于后者；在解除休眠期，小黃酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量（1.41 mg/g）極顯著地小于香酸野蘋果枝條中的可溶性蛋白含量（1.69 mg/g）。無論是在原生境中還是在引種資源圃中，小黃酸野蘋果與香酸野蘋果在其休眠前期和休眠期枝條中的可溶性蛋白含量均無顯著差異，而在解除休眠期其含量卻有差異。

表2 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中可溶性蛋白含量的差異分析結果Table 2 Analysis results of soluble protein content in branches of M.sieversii f.luteolus and M.sieversii f.aromaticus at different dormancy periods mg/g

2.3 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的可溶性糖含量的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條中的可溶性糖含量見表3。由表3可知，在原生境中，休眠前期與解除休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中的可溶性糖含量均無顯著差異（P＞0.05）；休眠期小黃酸野蘋果的可溶性糖含量（5.22%）顯著低于香酸野蘋果的可溶性糖含量（5.63%，P＜0.05）。在引種資源圃中，休眠期與解除休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的可溶性糖含量均無顯著差異（P＞0.05）；休眠前期小黃酸野蘋果的可溶性糖含量（2.57%）極顯著地小于香酸野蘋果的可溶性糖含量（2.92%，P＜0.01）。比較分析可知，引種資源圃中的小黃酸野蘋果和香酸野蘋果，在其休眠前期，枝條中可溶性糖的含量差異極顯著（P＜0.01）；原生境中的小黃酸野蘋果和香酸野蘋果，在其休眠期，枝條中可溶性糖的含量差異顯著（P＜0.05）；在其解除休眠期，無論是引種資源圃中還是原生境中的小黃酸野蘋果和香酸野蘋果，枝條中的可溶性糖含量均無顯著性差異。

表3 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中可溶性糖含量的差異分析結果Table 3 Analysis results of soluble sugar content in branches of M.sieversii f.luteolus and M.sieversii f.aromaticus at different dormancy periods %

2.4 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的游離脯氨酸含量的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條中的游離脯氨酸含量見表4。由表4可知，在原生境中，休眠前期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（142.21 μg/g）顯著高于香酸野蘋果的游離脯氨酸含量（122.03 μg/g，P＜0.05）；休眠期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（83.71 μg/g）極顯著高于香酸野蘋果的游離脯氨酸含量（45.54 μg/g，P＜0.01）；解除休眠期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（183.64 μg/g）極顯著低于香酸野蘋果的游離脯氨酸含量（298.45 μg/g，P＜0.01）。在引種資源圃中，休眠前期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（60.32 μg/g）極顯著低于香酸野蘋果的脯氨酸含量97.23 （μg/g，P＜0.01）；休眠期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（55.74 μg/g）極顯著高于香酸野蘋果的脯氨酸含量（33.89 μg/g，P＜0.01）；解除休眠期小黃酸野蘋果的游離脯氨酸含量（146.49 μg/g）極顯著低于香酸野蘋果的脯氨酸含量（357.47 μg/g，P＜0.01）。比較分析可知，小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中的游離脯氨酸含量，原生境中的明顯高于引種資源圃中的。

表4 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中游離脯氨酸含量的差異分析結果Table 4 Analysis results of free proline content in branches of M.sieversii f.luteolus and M.sieversii f.aromaticus at different dormancy periods μg/g

2.5 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的丙二醛（MDA）含量的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條中的丙二醛（MDA）含量見表5。由表5可知，在原生境中，休眠前期小黃酸野蘋果的MDA含量（21.37 μmol/g）極顯著高于香酸野蘋果的MDA含量（17.54 μmol/g，P＜0.01）；休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的MDA含量無顯著差異（P＞0.05）；解除休眠期小黃酸野蘋果的MDA含量（7.85 μmol/g）極顯著高于香酸野蘋果的MDA含量（2.91 μmol/g，P＜0.01）。在引種資源圃中，休眠前期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的MDA含量無顯著差異（P＞0.05）；休眠期小黃酸野蘋果的MDA含量（11.46 μmol/g）極顯著高于香酸野蘋果的MDA含量（4.3 μmol/g，P＜0.01）；解除休眠期小黃酸野蘋果的MDA含量（5.36 μmol/g）極顯著高于香酸野蘋果的MDA含量（4.65 μmol/g，P＜0.01）。比較分析可知，小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的MDA含量，只有在原生境中休眠期和引種資源圃中休眠前期的差異不顯著，而在其他休眠時期的差異均極顯著。

表5 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條中丙二醛(MDA)含量的差異分析結果Table 5 Analysis results of malondialdehyde (MDA) content in branches of M.sieversii f.luteolus and M.sieversii f.aromaticus at different dormancy periods μmol/g

2.6 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的超氧化物歧化酶（SOD）活性的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條的超氧化物歧化酶（SOD）活性見表6。由表6可知，在原生境中，休眠前期、休眠期、解除休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的SOD活性均無顯著差異（P＞0.05）。在引種資源圃中，休眠期小黃酸野蘋果的SOD活性為47.1 U/(g·h)，香酸野蘋果的SOD活性為44.98 U/(g·h)，前者極顯著高于后者（P＜0.01）；在休眠前期與解除休眠期，小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的SOD活性均無顯著差異（P＞0.05）。比較分析可知，僅有引種資源圃中處于休眠期的小黃酸野蘋果和香酸野蘋果其SOD活性存在差異，而原生境中不同休眠時期兩個品種新疆野蘋果的SOD活性均無顯著差異。

表6 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條的超氧化物歧化酶（SOD）活性的差異分析結果Table 6 Analysis results of superoxide dismutase (SOD) activity of branches from Different dormancy periods of Malus sieversii f.luteolus and Malus sieversii f.aromaticus U/(g·h)

2.7 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的過氧化物酶（POD）活性的差異分析

不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果1年生枝條的過氧化物酶（POD）活性見表7。由表7可知，在原生境中，休眠前期小黃酸野蘋果的POD活性為53.75 U/(g·min)，香酸野蘋果的POD活性為70.2 U/(g·min)，前者極顯著低于后者（P＜0.01）；休眠期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果的POD活性無顯著差異（P＞0.05）；解除休眠期小黃酸野蘋果的POD活性為206.19 U/(g·min)，香酸野蘋果的POD活性為236.37 U/(g·min)，前者極顯著低于后者（P＜0.01）。在引種資源圃中，休眠前期小黃酸野蘋果的POD活性為47.53 U/(g·min)，香酸野蘋果的POD活性為86.27 U/(g·min)，前者極顯著低于后者（P＜0.01）；休眠期小黃酸野蘋果的POD活性為188.23 U/(g·min)，香酸野蘋果的POD活性為295.17 U/(g·min)，前者極顯著低于后者（P＜0.01）；解除休眠期小黃酸野蘋果的POD活性為168.96 U/(g·min)，香酸野蘋果的POD活性為240.7 U/(g·min)，前者極顯著低于后者（P＜0.01）。比較分析可知，只有在原生境中休眠期的小黃酸野蘋果和香酸野蘋果其POD活性的差異不顯著。

表7 不同休眠時期小黃酸野蘋果和香酸野蘋果枝條的過氧化物酶（POD）活性的差異分析結果Table 7 Analysis results of POD activity of branches in different dormancy periods of Malus sieversii f.luteolus and Malus sieversii f.aromaticus U/(g·min)

2.8 兩個種下類型新疆野蘋果在不同休眠時期的抗寒性的綜合評價

本研究選取7個能夠反映新疆野蘋果抗寒性的生理指標，其分別為電導率（X1）、可溶性蛋白含量（X2）、可溶性糖含量（X3）、脯氨酸含量（X4）、丙二醛（MDA）含量（X5）、超氧化物歧化酶（SOD）活性（X6）、過氧化物酶（POD）活性（X7），使用SPSS軟件對所測原始數據經標準化處理后的數據進行主成分分析，從中提取出2個主成分，其分別為Y1、Y2，根據2個主成分的系數，得到下列Y1、Y2的線性組合：

Y1=0.43X1-0.43X2-0.32X3+0.46X4-0.21X5+0.51X6+0.04X7；

Y2=0.14X1+0.33X2+0.45X3+0.06X4-0.54X5+0.11X6+0.59X7。

這2個主成分的特征向量見表8，得到的2個主成分能夠代表各項生理指標的86.3%的信息。其中，主成分1的特征值為3.399，其貢獻率為48.6%；主成分2的特征值為2.641，其貢獻率為37.7%。

表8 主成分的特征向量Table 8 Eigenvectors of principal components

這2個主成分的載荷矩陣見表9。主成分1主要反映的是超氧化物歧化酶（SOD）活性（X6）、脯氨酸（X4）、相對電導率（X1）的信息，主成分2主要反映的是過氧化物酶（POD）活性（X7）、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量的信息。

表9 主成分的荷載矩陣Table 9 Load matrix of principal component

3 討 論

3.1 膜透性與抗寒性的關系

相對電導率是一種較為直觀地表示植物在低溫下細胞質膜透性變化情況的指標[11]。前人有關蘋果[12]抗寒性的研究結果表明，植物在受到低溫傷害時，抗寒性強的品種其膜結構穩定，而其相對電導率低。歐歡等[13]的研究結果表明，從11月中旬開始的整個越冬期間，隨著溫度降低，扁桃電解質滲透率增加，且在1月中旬出現最大值，之后隨著溫度回暖，其電解質滲透率逐步下降，同時丙二醛含量也呈現先上升后下降的變化趨勢。本研究結果表明，在越冬過程中的不同休眠時期，小黃酸野蘋果的相對電導率始終低于香酸野蘋果的，這與前人的觀點基本一致。此外，在自然越冬過程中，小黃酸野蘋果的電導率從休眠前期進入休眠期先緩慢下降，而在解除休眠期又上升；其丙二醛含量從休眠前期進入休眠期先快速下降然后維持相對穩定，這與歐歡等[13]的研究結果不一致。這可能與試驗材料新疆野蘋果與扁桃存在較大差異、供試樣品所在地的溫度相對更低、采樣時間和頻次不同等都有一定的關系；其次可能與新疆野蘋果長期適應環境形成了獨特的抗寒反饋機制，當枝條進入休眠期后能通過自身保護物質分解過量的丙二醛含量以保護膜質的相對穩定有關。對此問題還需在后續的研究中作進一步的探討。張瑜[14]對菲油果的研究結果表明，質膜透性與菲油果的抗寒性密切相關，這與本研究得出的相對電導率可作為抗寒的主要測定指標的觀點相同。

3.2 滲透調節物質與抗寒性的關系

可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸均為重要的滲透調節物質，對于維持細胞膜結構的完整發揮著重要作用[15-18]。劉大林[19]的研究結果表明，抗寒性強的土種番石榴通過增加可溶性蛋白含量來提高其細胞液的濃度，以維持膜結構的穩定。林玉友[20]的研究結果表明，抗寒性較強的野生種芽中糖含量在整個越冬期間的變化幅度較小。李葉云等[21]有關茶的研究結果表明，越冬前期其可溶性蛋白、可溶性糖含量均呈上升趨勢，其最大值都大致出現在12月，進入越冬后期其可溶性蛋白、可溶性糖含量均呈下降趨勢。

本研究結果表明，在自然越冬過程中，不同種下類型小黃酸和香酸野蘋果的可溶性蛋白、可溶性糖含量的變化趨勢與前人的研究結果均一致；此外，在休眠前期進入休眠期的過程中，其脯氨酸含量均呈下降趨勢，其最小值均出現在休眠期；進入解除休眠期，其脯氨酸含量均出現急劇升高的趨勢。這一結果與前人研究的結果不同，其原因可能是，小黃酸野蘋果和香酸野蘋果在休眠前期主要依靠快速積累可溶性蛋白和可溶性糖含量以用于增強自身的抗寒能力，此階段脯氨酸的積累速率比可溶性蛋白和可溶性糖的積累速率要小。解除休眠期游離脯氨酸含量急劇增加，這可能是植物為保護膜結構的穩定性以應對解除休眠期因高濃度的H2O2而形成的特殊抗寒機制。在解除休眠期，小黃酸野蘋果可溶性蛋白含量的最小值為1.41 mg/g，顯著低于香酸野蘋果的最小值1.69 mg/g。這一結果與前人研究的結果不一致，這可能與倒春寒有密切聯系，面對解除休眠期突如其來的低溫，抗寒性強的小黃酸野蘋果分解出更多的可溶性蛋白，以用于提高細胞滲透壓，從而更快地應對外界的傷害。引種資源圃中，休眠前期的可溶性糖含量，小黃酸野蘋果顯著低于香酸野蘋果。這一結果與前人研究的結果也不一致，其原因可能是，小黃酸野蘋果對逐漸下降的氣溫的敏感性強于香酸野蘋果，其能分解出更多的可溶性糖以滿足低溫馴化所需能量。

3.3 保護酶活性與抗寒性的關系

SOD、POD作為酶促反應的重要組成成分能夠清除植物體內積累的活性氧等有害物質，維持膜結構的穩定性[22]。吳建慧等[23]的研究結果表明，隨著脅迫溫度的下降，玉米幼苗葉片的POD活性整體呈現出先升高后降低的變化趨勢。李葉云等[21]有關茶樹和韓浩章等[24]有關香樟的研究結果都表明：自然越冬時期的不同階段其SOD活性整體均呈休眠期先增加而解除休眠期又降低的變化趨勢。司劍華等[25]對檉柳的研究結果表明，品種的抗寒性與SOD的活性呈正相關。

本研究結果表明，隨著自然越冬時期的推移，小黃酸野蘋果和香酸野蘋果在原生境與引種資源圃中其POD活性整體均呈先升高后降低的變化趨勢，這與前人研究得出的觀點基本一致；其SOD活性整體均呈現出休眠期先降低而解除休眠期又大幅增加的變化趨勢，這跟李葉云等[21]有關茶樹的研究結果不同。本研究結果與前人研究結果不一致的原因可能是，新疆野蘋果經過長期對環境的適應而形成了特殊的越冬機制，解除休眠期其SOD大量增加以有效清除氧化物質H2O2從而保證其安全越冬。此外，在引種資源圃中休眠期蘋果枝條中的SOD活性，小黃酸野蘋果顯著高于香酸野蘋果，這一結果與前人研究得出的品種抗寒性與其SOD活性呈正相關的結果相同，此結論只在對引種資源圃內新疆野蘋果的研究中得出，而在對原生境新疆野蘋果的研究中無法得到驗證，對此問題尚需進一步的研究。

新疆野蘋果的抗寒性與其獨特的地理區域環境密切相關，抗寒性的表現受到基因和環境的共同影響，本研究重點關注了新疆野蘋果在生理生化方面的表現，同時試驗樣品、采樣時間采樣地點、生理指標的測定方法、試驗樣品個體間差異等因素對其抗寒生理機制的研究均有影響，為了完善新疆野蘋果抗寒性機制的研究，后續研究有待于從分子水平進一步闡明新疆野蘋果抗寒性分子機理。

4 結 論

通過主成分分析可知，超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸含量、相對電導率可作為新疆野蘋果抗寒性的主要測定指標。由所測數據可初步推斷出，脯氨酸、POD、可溶性糖在小黃酸野蘋果休眠前期，脯氨酸、SOD、POD、丙二醛在其休眠期，脯氨酸、可溶性蛋白、POD、丙二醛在其解除休眠期的抗寒中均發揮著主要作用。