健脾溫陽通絡法對類風濕關節炎寒濕痹阻證患者MIR22HG表達水平及凋亡和高凝指標的影響

王馨,劉健,文建庭,王杰,忻凌,萬磊,姜輝,孫玥，王桂珍，陳瑞蓮

安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科,合肥 230031

類風濕關節炎(RA)是一種以對稱性、多關節炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其在世界上的發病率為1%，患者多集中在40～60歲，嚴重威脅著人類健康，其具體發病機制不明[1]?；こ衫w維細胞(FLS)是RA病理變化過程中的主要效應細胞[2]。RA的病理機制主要體現在RA-FLS的凋亡逃逸和增殖過度[3]，也表現為凝血纖溶系統的失衡和機體的高凝狀態[4]。長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)過去被認為沒有編碼蛋白質能力[5]，目前大量研究證實，lncRNA具有免疫調節等作用，參與RA的炎癥、凋亡等過程[6]。本團隊前期通過高通量測序及GO分析研究，認為LncRNA MIR22HG(MIR22HG)是參與RA凋亡的關鍵lncRNA，在RA患者體內高表達[7]。

寒濕痹阻證是RA的常見證型之一[8]，RA寒濕痹阻證屬于中醫“寒痹”范疇，臨床表現為關節怕冷、酸痛不適，伴畏寒、乏力、疲倦、頭暈、食欲不振、腹瀉、腹脹、舌淡、苔薄白、脈細弱等癥狀[9]。劉健教授以新安醫學為指導，立足于臨床實踐，創制具有健脾化濕，溫陽通絡作用的中藥復方新風膠囊(XFC，由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成，專利號：ZL201310011369.8，皖藥制字：Z20050062)和五味溫通除痹膠囊(WWT，由桂枝、淫羊藿、片姜黃、茯苓、黃芩組成。專利號:ZL 20111 0095 704.8)長期應用于臨床，療效顯著[10]。XFC、WWT可促進細胞凋亡，抑制高凝狀態[11-12]，XFC和WWT聯合使用可減輕RA關節癥狀，改善系統病變，改善患者感受[13]。但是RA寒濕痹阻證患者的MIR22HG表達和凋亡凝血指標是否存在異常以及XFC和WWT聯合用藥對其的影響作用尚不明確。

回顧性數據挖掘是基于數據挖掘方法進行的回顧性研究，其中包括頻數分析、關聯規則分析、相關性分析和隨機行走等方法[14]。

本文采用回顧性數據挖掘之關聯規則分析方法，觀察RA寒濕證患者MIR22HG的表達及凋亡、凝血纖溶指標的變化，研究XFC聯合WWT干預后對其的影響，為XFC聯合WWT的健脾化濕溫陽通絡法治療RA寒濕痹阻證臨床應用提供實驗依據，為中醫藥治療RA提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年10月至12月安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科住院RA住院患者100例，30例健康者來自同一醫院健康體檢中心。本研究經安徽中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準(編號：2019AH-12)。

1.2 診斷標準 納入RA患者均符合2010年美國風濕病學會(ACR)聯合歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)提出的診斷標準[15-16]，辨證參照2018年類風濕關節炎病證結合診療指南[9]。

1.3 納入與排除標準 納入標準：符合上述診斷標準；使用XFC和WWT(服用方法：口服，3次/d，3粒/次)，同時治療方案中醫辨證論治[9]寒濕痹阻證，每日1劑，均以4周為一療程。治療藥物由本院藥學部和制劑室提供)，必要時可使用非甾體類解熱鎮痛抗炎藥；有完整的治療前后實驗室指標。排除標準：合并有心、肝、腎等嚴重疾病以及嚴重關節外表現；年齡在18歲以下，75歲以上者；孕婦或哺乳期女性；精神病患者；關節嚴重畸形，完全喪失關節功能者；觀察期間應用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

1.4 分組及觀察指標 選擇30例健康體檢人群為健康對照組，100例RA寒濕痹阻證患者治療前為RA寒濕組，經治療為XFC+WWT組，比較RA寒濕組和健康對照組中MIR22HG水平、凝血和凋亡指標。臨床指標：LncRNA：MIR22HG；凝血指標：血小板計數(PLT)、纖維蛋白原(FBG)、D-二聚體(D-dimer)、部分凝血活酶時間(APTT)、血小板活化因子(PAF)和前列腺素I2(PGI2)；凋亡指標：B細胞淋巴瘤2相關X蛋白(Bax)和B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)。

1.5 實驗藥物、試劑 實驗藥物、試劑：XFC、WWT(每粒均含生藥0.4g，安徽中醫藥大學第一附屬醫院)，ELISA試劑盒(JYM0155Hu，JYM0082Hu，武漢基因美生物科技公司)。

1.6 方法

1.6.1 回顧性數據挖掘 檢索自建數據庫2020年10月至12月的健脾化濕溫陽通絡法治療RA寒濕證的病例，采用頻數分析、復雜網絡分析技術、關聯規則分析等數據挖掘的方法分析總結健脾化濕溫陽通絡法對RA寒濕證化的治療作用。

1.6.2 關聯規則分析 采用SPSS Modeler 18.0 中的Aprior模塊分析XFC聯合WWT與MIR22HG、凋亡指標及凝血指標之間的關聯性[17]?！坝小比≈刀椤癟”，“無”取值定為“F”。指標改善定為“T”，指標未改善定為“F”。包括補充缺失數據，剔除錯誤數據。

1.6.3 相關性分析 采用Spearman 相關性分析分析MIR22HG與凋亡指標和凝血纖溶指標之間關系。P<0.05為差異有統計學意義。

1.6.4 RT-qPCR檢測MIR22HG mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達 Trizol提取各組總RNA，逆轉錄反應，進行擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32凝膠圖像分析軟件對PCR產物進行半定量分析，以β-actin表達量為參照采用2-△△Ct進行相對定量分析。引物：MIR22HG正向引物為5′-AAGTGTGGCTCTGTGCCTAT-3′，正向引物為5′-ATCTTCAGGCCTTGCCTTCT-3′，β-actin正向引物為5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，正向引物為5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′。

1.6.5 ELISA法檢測細胞因子PAF、PGI2的表達 收集各組培養上清液，1 000 r/min離心10min，棄去沉淀。將上清液加入酶標板中(每孔100 μL)，37 ℃孵育1.5 h，采用 ELISA 方法，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定490 nm處的OD值，以上重復3次。

2 結果

2.1 RA寒濕痹阻證患者MIR22HG、凝血和細胞凋亡指標的變化 與健康對照組相比，RA寒濕組患者MIR22HG、PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bcl-2升高，PGI2、Bax降低(P<0.05)。見表1。

表1 RA寒濕痹阻證患者MIR22HG、凝血和凋亡指標的變化

2.2 RA寒濕痹阻證MIR22HG與凋亡指標和凝血指標的相關性分析 相關性分析顯示，FBG、D-dimer、PLT、PGI2與MIR22HG呈正相關，APTT、Bax與MIR22HG呈負相關(P<0.05)。見圖1。

圖1 類風濕關節炎寒濕痹阻證患者MIR22HG與凋亡指標和凝血指標的相關性分析

2.3 RA寒濕痹阻證MIR22HG與凋亡、凝血指標的關聯規則分析 設定后項為MIR22HG，后項為凋亡、凝血指標，最小支持度為20%，最小置信度為60%。經Aprior 模塊分析，MIR22HG表達升高與Bax、APTT降低和PAF、D-dimer、FBG、Bcl-2和PLT升高的支持度大于45%、置信度均大于95%、提升度均大于1，具有關聯性。見表2。

表2 RA寒濕痹阻證患者MIR22HG與凝血纖溶指標和凋亡指標的關聯規則分析

2.4 RA寒濕痹阻證治療前后MIR22HG、凝血指標及凋亡指標的變化 與治療前相比，RA寒濕痹阻證患者治療后PGI2、Bax升高，PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bcl-2和MIR22HG降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。見表3。

表3 RA寒濕痹阻證治療前后凝血指標及其余各指標的變化

2.5 XFC+WWT與治療前后凝血指標及其余各指標改善的關聯規則分析 設定前項為XFC+WWT，后項為實驗室指標，最小支持度為20%，最小置信度為40%。經Aprior 模塊分析，XFC+WWT與凝血指標APTT、PAF、PGI2、D-dimer和凋亡指標Bcl-2、Bax改善的支持度均大于40%、置信度均大于45%、提升度均大于1，具有關聯性。見表4，圖2。

表4 XFC+WWT與治療前后凝血指標、凋亡指標、MIR22HG改善的關聯規則分析

圖2 XFC+WWT與治療前后凝血指標、凋亡指標、MIR22HG改善的關聯規則分析圖

3 討論

本研究以中醫學理論為指導，認為RA寒濕證的中醫學病機類似于由基因調控導致的凋亡不足、高凝狀態的現代分子機制[18]。目前有許多關于lncRNA的研究發現，表達失調的lncRNAs可參與調節RA的免疫炎癥反應和凋亡過程[19]。故以LncRNA和凋亡、凝血指標為研究對象，基于回顧性數據挖掘方法探討中藥復方XFC+WWT治療RA寒濕證的研究。

目前國內中醫學者治療RA寒濕痹阻證主要以標本兼治為主，李彥民教授以溫陽補虛，清熱解毒之桂芍知母治尪湯治寒濕阻絡型類風濕關節炎，促進免疫活化，抑制炎癥反應[20]。左瑞庭加味五痹湯聯合甲氨蝶呤治療寒濕痹阻型RA，可改善骨破壞、阻滯炎癥因子釋放、促進氧自由基排除，明顯改善患者感受[21]。本研究針對RA寒濕痹阻證提出了健脾化濕，溫陽通絡的新安健脾系列方新風膠囊、五味溫通除痹膠囊。本團隊前期已分別對其開展了相關研究表明，新風膠囊能不同程度改善RA寒濕癥狀，改善高凝狀態，改善RA關節癥狀[22]，五味溫通除痹膠囊能改善RA患者超敏C反應蛋白(hs-CRP)、抗環瓜氨酸肽抗體(CCP-AB)及免疫球蛋白M(IgM)等免疫炎癥指標[23]。但新風膠囊聯合五味溫通除痹膠囊對RA寒濕證凋亡和凝血指標的影響尚少報道。本文研究結果表明，RA寒濕痹阻證患者MIR22HG過表達，與FBG、D-dimer、PLT、PGI2呈正相關，與APTT、Bax呈負相關，PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bax升高，PGI2、Bcl-2降低。XFC聯合WWT能下調MIR22HG的表達，同時也能降低PLT、FBG、D-dimer、PAF、Bax，升高PGI2、Bcl-2。表明RA寒濕痹阻證患者存在MIR22HG基因高表達、凋亡逃逸和凝血纖溶系統的失衡狀態，XFC+WWT能降低高表達的MIR22HG，促進凋亡、改善高凝狀態。

具有健脾化濕溫陽通絡之效的新風膠囊和五味溫通除痹膠囊是國家發明專利產品?，F代藥理學研究表明，XFC中黃芪的有效成分三萜皂苷可調節凋亡相關因子caspase-3,Bax,Bcl-2的表達水平，細胞凋亡[24-26]。雷公藤可通過上調細胞內Ca2+濃度誘導細胞凋亡[27-28]。WWT中桂枝的活性成分桂皮油能擴張血管，增強外周血液循環，延長小鼠的出、凝血時間[29]。淫羊藿苷具有較好的抗炎、骨保護作用,能改善骨質疏松,且還能調節免疫系統功能的活性[30]。諸藥合用，能有效調節纖溶凝血系統失衡，促進凋亡，改善RA患者癥狀，共奏健脾化濕，溫陽通絡之功。

然而，此研究尚存在許多不足，對于MIR22HG是如何調控凝血凋亡等指標以及XFC聯合WWT是通過如何調控MIR22HG來影響凝血凋亡等指標尚未深入研究。因此，下一步我們將從系統生物學方面，利用基因干擾和過表達技術，進一步研究XFC+WWT治療RA寒濕痹阻證的機制。