基于網絡藥理學策略分析青蒿應用于新型冠狀病毒感染肺炎的可行性

杜偉，占敏霞，吳思瀾，張莉

重慶市中藥研究院，重慶 400065

新型冠狀病毒感染肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，以下簡稱新冠肺炎.新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)從首次被鑒別出至今已逾1年，因其具有較高的傳染性，持續對我國及全世界人民的生活產生不利影響.新冠肺炎患者初期以發熱、干咳、乏力為主要癥狀，部分患者可伴有納差、腹瀉等消化道癥狀或惡寒、肌痛，少數可能無發熱癥狀；隨病情進一步發展，中期及重癥期可出現口咽舌干、胸悶、呼吸困難、多臟器功能衰竭等表現[1-2].從既往的病毒感染治療策略來講，直接的病毒抑制是有效的方法之一，遺憾的是目前尚無針對新型冠狀病毒的特效抑制藥[3].從抗擊疫情的臨床實踐來講，中藥的應用發揮著重要積極的作用[3].

應用中藥，關鍵在于以中醫藥理論為支撐.新型冠狀病毒是新冠肺炎的致病因子，熱是新冠肺炎的重要病機之一[4].針對病機的辨證施治是現階段中醫藥治療新冠肺炎的主要手段，即統籌兼顧清熱的治法是一種重要的手段.青蒿(菊科植物黃花蒿的干燥地上部分ArtemisiaannuaL.)，為常用寒性清熱中藥，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效，臨床應用無毒性發生.推測青蒿具有應用于新冠肺炎的可行性.通過文獻分析，青蒿成分較多，存在多靶點的可能，故引入網絡藥理學方法進行快速分析[5]，以便促進新冠肺炎的更好防控.

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)，人類基因組注釋數據庫(GeneCards)，有機小分子生物活性數據庫(Pubchem)，蛋白相互作用數據庫STRING 11.0，UniProt數據庫，Cytoscape 3.6.1軟件，Omicshare云平臺.

1.2 青蒿的活性成分及靶點獲取

采用TCMSP數據庫，在“Herb name”項下，以“青蒿”為檢索詞，獲取青蒿已知的化學成分，篩選出具有良好口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)的化合物[5].根據篩選出的化合物，采用TCMSP數據庫和Pubchem數據庫進行靶點預測.將靶點預測結果導入UniProt數據庫進行基因的標準化處理，并導入STRING 11.0映射為人的基因.

1.3 新冠肺炎相關靶點獲取

以“Corona Virus Disease 2019”為檢索詞，在GeneCards數據庫中獲取新冠肺炎的相關靶點，篩選得分為10.00以上的靶點，得到目前治療新冠肺炎的相關靶點.

1.4 青蒿—活性成分—疾病靶點網絡的構建與分析

將1.2得到的青蒿活性成分及靶點與新冠肺炎相關靶點于Omicshare云平臺取交集，所得交集靶點即為青蒿作用于新冠肺炎的預測靶點.構建“藥物—活性成分—疾病—靶點”網絡圖，利用Cytoscape 3.6.1軟件中的“Network Analyzer”功能對青蒿化學成分—作用靶點網絡進行分析.節點(node)代表青蒿及其活性成分、疾病、靶點；邊(edge)展現青蒿與活性成分、活性成分與疾病、疾病與靶點之間的聯系.

1.5 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選

為進一步研究青蒿干預新冠肺炎的作用機制，將1.4交集得到的靶點導入STRING 11.0進行蛋白質與蛋白質相互作用(PPI)分析，將種屬設置為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設置為0.400，網絡邊含義設置為“molecular action”，其余參數保持默認設置，得到青蒿作用于新冠肺炎的PPI網絡.借助Cytoscape 3.6.1軟件中的“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲分析，選取自由度(Degree)大于平均值的靶點為關鍵靶點[6].

1.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將1.5篩選出的關鍵靶點運用STRING 11.0 “Analysis”功能，進行基因功能(gene ontology，GO)分析和基于京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析[7].

2 結 果

2.1 青蒿活性成分及靶點的篩選結果

在TCMSP中獲得216個化合物，設定OB≥30%，DL≥0.18，得到化合物22個，逐一對應發現3個化合物無對應靶點，分別是青蒿烯(artemisitene)、維采寧-2(vicenin-2_qt)、雙氫青蒿素(dihydroartemisinin).采用Pubchem數據庫對TCMSP未預測出靶點的3個化合物進行預測，仍未獲得靶點信息，故青蒿活性成分為19個(表1)，對應182個靶點.

表1 青蒿活性成分信息表

2.2 新冠肺炎靶點獲取結果

從GeneCards數據庫中檢索到新冠肺炎相關靶點60個，設定分值(S≥10.00)后，得到41個靶點.

2.3 青蒿—活性成分—疾病靶點網絡的構建與分析

將182個化合物靶點與41個新冠肺炎靶點取交集，得到13個交集基因(圖1)，對應青蒿中14個化合物.利用Cytoscape 3.6.1軟件構建青蒿—活性成分—疾病靶點相互作用網絡，網絡中有29個節點和114條邊(圖2).圖2中綠色填充為青蒿，紫色填充為活性成分，紅色填充為靶點，黃色填充為新冠肺炎.圖中槲皮素、木犀草素、山奈酚等黃酮類化合物度值較高，靶點為NOS2的化合物有12個，分別為澤蘭黃醇素、檉柳黃素、藤菊黃素、茵陳黃酮、艾黃素、薊黃素、線薊素、牡荊苷、甲氧基萬壽菊素、芹菜素-6，8-C-二葡萄糖苷、異鼠李素和山奈酚.

圖1 青蒿化合物靶點與新冠肺炎靶點取交集結果

圖2 青蒿干預新冠肺炎“藥物—活性成分—疾病靶點”網絡圖

2.4 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選結果

將13個交集基因通過STRING 11.0進行PPI網絡分析(圖3)，可知網絡所有靶點均可以發生蛋白相互作用，128條邊代表了蛋白之間的相互作用.網絡中各節點的平均自由度為9.8，篩選后得到7個核心靶點(IL6，TNF，CCL2，IL1B，NOS2，TP53，CASP3)，見表2.

表2 PPI網絡中核心靶點一覽表

2.5 GO功能分析結果

7個青蒿—新冠肺炎核心基因影響了266個生物學過程(p<0.01，FDR<0.01).選取FDR值排名前20的功能信息(圖4)，結果顯示核心基因主要富集在細胞對生物刺激的反應、細胞因子介導的信號通路、對脂多糖的反應、對生物刺激的反應等生物過程中.

圖3 藥物—疾病PPI網絡圖

圖4 青蒿干預新冠肺炎關鍵靶點GO富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析結果

7個青蒿—新冠肺炎核心基因富集在59條通路上(p<0.01，FDR<0.01)，選取FDR值排名前20的通路(圖5)，其中與抗病毒密切相關的通路包括NOD樣受體信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路.

3 討論與結論

新冠肺炎是新發的傳染性疾病，對居民日常起居、睡眠和生活習慣均產生了不利影響[8]，甚至危及生命.本文運用網絡藥理學的方法，系統分析青蒿干預新冠肺炎的機理.首先通過查詢數據庫獲取青蒿中的活性成分以及靶點信息，將獲取的靶點信息與疾病的靶點信息取交集后構建“藥物—成分—疾病”靶點網絡圖，從而識別核心靶點干預的基本生物學功能和疾病信號轉導通路，進而揭示青蒿對新冠肺炎作用的可能機制[9].

圖5 青蒿干預新冠肺炎關鍵靶點參與通路富集信息圖

通過對TCMSP數據庫及Pubchem數據庫的查詢、分析得出，青蒿干預新冠肺炎的活性成分有14個，其中12個活性成分均可作用于NOS2.活性成分中度值較高的黃酮類化合物已有研究報道，槲皮素、山奈酚、木犀草素與新冠肺炎推薦藥的親和力相似[10-11].槲皮素、山奈酚、木犀草素均為常見的中藥化學成分，對它們的研究較早、較多，具有抗炎、抗氧化應激等作用[12-13].對新冠肺炎逝者解剖結果顯示，巨噬細胞滲出性炎癥是重要的病理表現[14]，表明槲皮素、山奈酚、木犀草素是干預新冠肺炎發病過程的有效成分，而靶點為NOS2的其他活性成分也是關注的重點.

NOS2是本研究的核心靶點之一，其在免疫、炎癥、腫瘤、病毒感染等方面均能發揮作用[15].在流感病毒致死的基因組研究中，NOS2與存活率相關，其證據是患者死亡前24h內NOS2表達異常上調[16].針對巨病毒的研究亦認為，NOS2的缺乏是致死的重要原因[17].此外，缺氧可誘導NOS2高表達[18].新冠肺炎解剖提示肺通氣—換氣功能障礙[14]，表明NOS2與新冠肺炎密切相關.

TNF/NOS2是巨噬細胞在感染后啟動固有免疫防御的重要信號通路[19].感染可激活固有免疫細胞，固有免疫分子發揮固有免疫防御是免疫學的共識.新型冠狀病毒感染激活的主要是巨噬細胞，巨噬細胞分泌TNF以抑制病毒復制，TNF的過表達促進TNF/NOS2信號通路啟動，導致IL-6，IL1B等炎癥因子過表達，IL過表達會加重炎癥[20]，新冠肺炎臨床研究也證實了這一點[21].核心靶點的GO功能富集分析印證了青蒿通過信號轉導等生物過程干預新冠肺炎.通過對KEGG通路分析，青蒿可作用于TNF/NOS2信號通路的多個靶點，認為青蒿可能通過TNF/NOS2信號通路減輕新冠肺炎的肺部炎性損傷.

綜上所述，本文采用網絡藥理學的策略對青蒿中的活性成分、作用靶點及通路進行了快速分析，表明青蒿應用于新冠肺炎具有一定的可行性，揭示青蒿通過多成分、多靶點、多途徑作用于新冠肺炎，主要的作用通路為TNF/NOS2信號通路.