Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的合成及多模式抗腫瘤研究

陸娟，殷琪峰，胡珊珊，楊駿

1. 西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715； 2. 上海航天控制技術(shù)研究所，上海 201109

近年來，在光熱治療領(lǐng)域，許多能有效吸收近紅外光的光熱劑被逐漸發(fā)掘出來，銅基二元/三元硫?qū)倩衔锛词瞧渲袠O具代表性的一類[1-4]，它們在近紅外區(qū)具有較強的局部表面等離子體激元共振吸收，這一特點使其具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力[5-9]．由于銅原子的缺失，Cu2-xE(E=S，Se，Te，0≤x≤1)系列化合物也有著較強的等離子體激元共振吸收和優(yōu)異的光熱性能[10]，通過改變x的具體數(shù)值可以調(diào)節(jié)其等離子體激元共振吸收性質(zhì)[11-13]。

基于此，本研究構(gòu)建了基于Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的光熱/化學(xué)動力學(xué)/化學(xué)治療三模式乏氧治療體系．在整個體系中，光熱劑Cu2-xSe納米粒子產(chǎn)生的高熱不僅發(fā)揮了其本身光熱治療的作用，而且還同腫瘤微環(huán)境的酸性pH共同促進了MIL-100(Fe)芬頓反應(yīng)的進行以及藥物阿霉素的釋放，提高了治療效率．更重要的一點是，光熱、化學(xué)動力學(xué)以及化學(xué)治療都是不依賴氧氣的治療方式，因此本研究構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX在乏氧腫瘤治療領(lǐng)域有著一定的潛在應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

儀器：Rigaku D/max-TTR-Ⅲ衍射儀(Cu-Kα輻射λ=0.154 05 nm)，F(xiàn)EI Tecnai G2 S-Twin透射電子顯微鏡，Leica SP8設(shè)備，表面分析系統(tǒng)(Thermofisher Escalab Xi+)。

試劑：CuCl(AR)，NH2-PEG(2000)-NH2(AR)，EDC(AR)，NHS(AR)，PVP(AR)，F(xiàn)eCl3(AR)，H3BTC(AR)以及油胺、十八烯、無水乙醇均為分析級，未進一步純化而直接用于實驗過程。

1.2 Cu2-xSe@MIL-100(Fe)的合成

1.2.1 硒-油胺(Se-OAm)前驅(qū)體的合成

取10 mmol硒粉與10 mL油胺于三頸瓶中，將此溶液加熱至140 ℃，打開真空泵，使瓶內(nèi)保持真空狀態(tài)30 min以除去溶液中的低沸點溶劑雜質(zhì)，接著關(guān)閉真空泵，通入氮氣，繼續(xù)將溶液加熱至320 ℃，在氮氣環(huán)境中反應(yīng)30 min制得Se-OAm前驅(qū)體[14]。

1.2.2 Cu2-xSe納米粒子的合成

根據(jù)文獻[15]合成了Cu2-xSe納米粒子．取0.5 mmol氯化亞銅、8mL十八烯和2mL油胺于四頸瓶中，將此溶液加熱至140 ℃，打開真空泵，使瓶內(nèi)保持真空狀態(tài)30 min以除去低沸點溶劑雜質(zhì)，接著關(guān)閉真空泵，通入氮氣，將溶液加熱至200 ℃時立即用注射器將Se—OAm前驅(qū)體快速注入到四頸瓶中，接著將溫度升至220 ℃并保持1 h．反應(yīng)后的溶液用乙醇、環(huán)己烷洗滌數(shù)次，即得到沉淀的Cu2-xSe納米粒子。

1.2.3 Cu2-xSe@MIL-100(Fe)核-殼材料的合成

室溫下，在燒杯中將合成的Cu2-xSe納米粒子分散在30 mg聚乙烯吡咯烷酮的三氯甲烷溶液中并攪拌12 h，然后離心收集沉淀得到聚乙烯吡咯烷酮修飾的Cu2-xSe納米粒子．接著將所得粒子分散在乙醇中，加入一定量的氯化鐵，攪拌30 min后再逐滴加入與氯化鐵等質(zhì)量的量的均苯三甲酸，反應(yīng)24 h，產(chǎn)物用乙醇離心洗滌數(shù)次除去過量的反應(yīng)物，收集沉淀得到核-殼結(jié)構(gòu)的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)納米材料。

1.2.4 在Cu2-xSe@MIL-100(Fe)上負載阿霉素

將制備的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)溶于磷酸鹽緩沖溶液，加入一定量的阿霉素，室溫下避光攪拌24 h后離心洗滌除去過量的阿霉素，所得沉淀即為產(chǎn)物Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX．通過測定上層清液中阿霉素在480 nm處的紫外吸收強度以及阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算其擔(dān)載量[16-17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌、物相和元素分析

圖1是合成的Cu2-xSe和Cu2-xSe@MIL-100(Fe)納米粒子的透射電子顯微鏡(TEM)圖片．由圖1a可知，通過兩步高溫?zé)峤夥ㄔ谟托匀軇┲兄苽涑龅腃u2-xSe納米粒子呈現(xiàn)出清晰、均勻的球形形貌且粒徑大小為20 nm左右．而從圖1a中的HRTEM圖可以清晰地看到晶體的晶格條紋，證明了Cu2-xSe材料良好的結(jié)晶性．然后在三氯甲烷中將得到的Cu2-xSe納米粒子連接上聚乙烯吡咯烷酮進行轉(zhuǎn)水修飾，緊接著在乙醇中通過該粒子和氯化鐵、均苯三甲酸的一步反應(yīng)包覆上金屬有機骨架MIL-100(Fe)殼層，所得的Cu2-xSe@MIL-100(Fe) 粒子形貌見圖1b．從圖1b中可以看出，Cu2-xSe@MIL-100(Fe)粒子的形貌依舊保持了球形且有著明顯的內(nèi)核-外殼結(jié)構(gòu)，直徑增至140 nm左右．內(nèi)核直徑相對于圖1a的Cu2-xSe納米粒子直徑明顯變大，可能是由于納米粒子發(fā)生了聚沉。

a中插圖為HRTEM圖．圖1 Cu2-xSe和Cu2-xSe@MIL-100(Fe)納米粒子的TEM圖

圖2是制備的Cu2-xSe納米粒子的XRD圖．經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS No．06-0680)比對可知，所得材料的圖譜能與其標(biāo)準(zhǔn)圖譜的特征衍射峰匹配吻合，主要特征峰對應(yīng)的晶面有(111)、(220)、(311)和(422)．圖3是制備的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX納米粒子在純水和磷酸緩沖溶液(PBS)中的動力學(xué)光散射粒徑分布圖．從圖3可以看出，Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX納米粒子的粒徑與之前透射圖(圖1b)中觀察到的基本一致，且在水和磷酸緩沖溶液中均能穩(wěn)定分布，這為該粒子后續(xù)在水溶液和生物體環(huán)境中的分散及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

圖2 Cu2-xSe納米粒子的XRD圖

圖3 Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX納米粒子在純水和磷酸緩沖溶液中的動力學(xué)光散射粒徑分布圖

圖4是Cu2-xSe@MIL-100(Fe)納米粒子的N2吸附/脫附等溫線和相應(yīng)的孔徑分布圖．由圖4可知，其等溫線是典型的Ⅳ型等溫線且其孔道大小為25 nm，表明體系中存在著豐富的介孔孔道，同時經(jīng)測定可知樣品的比表面積為256.65 m2/g．體系較大的比表面積和孔道直徑保證了后續(xù)抗癌藥物阿霉素的擔(dān)載。

圖4 Cu2-xSe@MIL-100(Fe)納米粒子的N2吸附/脫附等溫線和孔徑分布

圖5是制備過程中各個樣品的Zeta電位變化圖．由圖5可知，在油胺/十八烯中合成的Cu2-xSe納米粒子表面帶負電荷(-12.3 mV)，在溶液中修飾上聚乙烯吡咯烷酮并包覆MIL-100(Fe)殼層后電荷轉(zhuǎn)正(+9.2 mV)．Zeta電位絕對值越大，體系的穩(wěn)定性越高，粒子不容易發(fā)生聚沉．因此，根據(jù)Zeta電位的數(shù)值變化可以分析解釋透射圖(圖1)中內(nèi)核粒子粒徑增大的原因．在溶液中修飾上聚乙烯吡咯烷酮即轉(zhuǎn)水修飾后，Cu2-xSe粒子的電位明顯降低，從而體系變得不穩(wěn)定，粒子發(fā)生聚沉致使粒徑變大．圖6是各樣品的紫外-可見吸收光譜圖，從圖6中可以看出在Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的吸收曲線中出現(xiàn)了DOX的特征吸收峰(480 nm附近)，表明材料中成功負載上了抗腫瘤藥物阿霉素[18-19]。

圖5 合成過程中樣品的Zeta電位變化圖

圖6 DOX，Cu2-xSe@MIL-100(Fe)及Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的紫外-可見吸收光譜圖

2.2 性能分析

配制了一系列梯度質(zhì)量濃度(80，40，20，10，5，0 μg/mL)的阿霉素溶液并檢測了其在480 nm特征波長處的吸光度，經(jīng)線性擬合得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7a)，圖7中阿霉素的紫外-可見吸光度(Y)與其濃度(X)的線性關(guān)系為Y=25.294X+0.025. 根據(jù)產(chǎn)物Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的紫外-可見吸收曲線以及朗伯-比爾定律可以估算出阿霉素的擔(dān)載率為40.3%．緊接著，探究了在不同pH值和光照條件下材料中阿霉素在溶液中的釋放曲線．如圖7b所示，在pH=7.4的磷酸緩沖溶液中，當(dāng)1 064 nm激光的功率設(shè)置為0，0.4，0.8 W/cm2時，阿霉素的釋放率分別為12.1%，21.3%，42.7%．可以看到，隨著激光功率的增大，阿霉素的釋放量明顯增加，這主要是因為激光功率的增大使得體系的光熱溫度提高，高熱促進了阿霉素的釋放．而從圖7c可知，當(dāng)磷酸緩沖溶液的pH調(diào)節(jié)為5.5時，在激光功率為0，0.4，0.8 W/cm2時，阿霉素的釋放率分別增加到了39.1%，48.1%，73.3%．相比于中性環(huán)境，酸性pH下DOX的釋放率更高．利用這一點，在腫瘤治療領(lǐng)域可以依賴腫瘤微酸性的環(huán)境促進藥物的定向釋放、增強治療效果．綜上可知，Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX體系實現(xiàn)了酸性pH/光熱的雙響應(yīng)釋放，因此可以有效地發(fā)揮藥物治療作用。

圖7 DOX溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線和pH=7.4 和5.5時Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料的阿霉素釋放曲線

考慮到羥基自由基壽命短、化學(xué)活性高的特點，使用電子順磁共振法(EPR)檢測了原位羥基自由基的生成[20-21]．將制備的材料與適量的過氧化氫混合，用相應(yīng)的磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5或7.4，再加入與材料等體積的捕獲劑5，5-二甲基-1-吡咯烷-N-氧化物，用1 064 nm激光照射1 min后進行檢測即可得到相應(yīng)的圖譜．圖8是在不同條件下測出的電子順磁共振譜圖．由圖8可知，所有譜圖中均出現(xiàn)了羥基自由基的四重特征信號峰，且在光照和酸性條件下材料的信號峰最強，即生成的羥基自由基最多最快．與阿霉素的pH/光熱的雙響應(yīng)釋放一樣，酸性pH與高熱的雙重刺激也促進了芬頓反應(yīng)的進行，有利于體系利用酸性的腫瘤微環(huán)境發(fā)展化學(xué)動力學(xué)治療．用2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)表征了材料生成活性氧的能力，使用共聚焦顯微鏡觀察細胞．如圖9所示，隨著時間的延長(2，4，6，8 min)，綠色熒光逐漸增強，即材料生成的活性氧越來越多．以上結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料有潛力在腫瘤微環(huán)境的條件下有效地生成活性氧。

圖8 以5，5-二甲基-1-吡咯烷-N-氧化物作捕獲劑的不同體系的EPR譜圖

所有細胞都用DCFH-DA標(biāo)記； 比例尺：50 μm，激光器的功率均為0.8 W/cm2．圖9 不同輻照時間Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX培養(yǎng)的海拉細胞的CLSM圖像

通過一系列實驗深入探究了Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料的光熱轉(zhuǎn)換能力．圖10a是不同質(zhì)量濃度(500，250，125，62.5，0 μg/mL)的材料被1 064 nm激光照射500 s后的溫度變化圖．從圖10中可以發(fā)現(xiàn)材料的質(zhì)量濃度越高，其能達到的最終溫度也越高，材料質(zhì)量濃度為500 μg/mL時最終溫度可達到50 ℃，這完全滿足了生物應(yīng)用中光熱治療的要求．圖10b與10c分別是1個和3個循環(huán)周期內(nèi)的溫度變化圖．以1 500 s為一個循環(huán)周期，持續(xù)用激光照射材料的水溶液750 s后關(guān)掉激光器讓材料自然冷卻，期間始終用熱紅外成像儀監(jiān)測材料的溫度變化并且每10 s記錄1次溫度值，循環(huán)3次．實驗結(jié)果表明，幾個循環(huán)周期內(nèi)材料的光熱溫度值和變化趨勢并沒有明顯的變化，即Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料具有良好的光熱穩(wěn)定性．根據(jù)循環(huán)曲線中的冷卻部分可以得到相應(yīng)的-lnθ值，將其與溫度進行線性擬合可以得到圖8d，其斜率值189.19為系統(tǒng)的時間常數(shù)τ_(s )的數(shù)值．據(jù)此，計算出材料Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX的光熱轉(zhuǎn)換效率η為51.21%[22-23]．如圖11所示，用1 064 nm激光分別輻照水和Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料的水溶液5 min，每隔1 min用紅外熱成像儀拍照記錄一次溶液的溫度．從紅外熱成像圖片中可以直觀地觀察到材料的溫度顏色從一開始的淡黃泛紅到變紅到最終呈白熱化的狀態(tài)，而作為對照組的溶劑水的顏色則一直保持著淡藍色的室溫狀態(tài)．實驗結(jié)果進一步證明了本研究構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力。

圖10 在1 064 nm激光照射下溫度變化圖

圖11 水和Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX在1 064 nm激光照射下的紅外熱成像圖

2.3 體外抗癌性能研究

實驗結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX體系具有良好的載藥性能、活性氧生成能力以及光熱轉(zhuǎn)換能力．于是我們進一步對材料的生物應(yīng)用進行了探究．為了確保材料在生物應(yīng)用時安全無害，首先進行了生物相容性實驗．將不同質(zhì)量濃度(500，250，125，62.5，31.3，15.6，7.8 μg/mL)的材料與L929成纖維細胞共同培養(yǎng)處理24 h后經(jīng)酶標(biāo)儀測定得各組細胞的存活率數(shù)值(圖12a)，每組細胞(包括材料質(zhì)量濃度高達500 μg/mL的培養(yǎng)細胞)的存活率均在90%以上，據(jù)此判斷材料具有良好的生物相容性．緊接著我們探究了材料對海拉腫瘤細胞的毒性，將海拉細胞分為不同組，設(shè)置其中一組為對照組，其余組細胞分別用光照、純阿霉素、Cu2-xSe+光照、Cu2-xSe@MIL-100(Fe)+光照、Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX+光照處理，經(jīng)過同樣的MTT處理得到相應(yīng)的細胞存活率數(shù)值(圖12b)．從圖12b的柱狀圖可知，對照組和1 064 nm光照組的細胞存活率均在90%以上，可見近紅外光照對細胞基本沒有損傷．而純阿霉素(500 μg/mL)處理的細胞存活率降至60%左右，表明阿霉素是一種有效的抗癌藥物．Cu2-xSe+光照、Cu2-xSe@MIL-100(Fe)+光照、Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX+光照處理的細胞存活率在材料質(zhì)量濃度為500 μg/mL時分別降低至60%，43%，20%左右．依次遞增的抗腫瘤細胞能力可分別歸因于逐步引入的光熱、化學(xué)動力學(xué)和藥物治療。

圖12 L929成纖維細胞與樣品共同培養(yǎng)后的體外存活率

為了更直觀地觀察抗腫瘤效果，使用碘化丙啶對細胞進行染色(紅色標(biāo)記死細胞)，用共聚焦顯微鏡觀察細胞樣品，結(jié)果見圖13。

用PI染色(死細胞，紅色)； 比例尺：100 μm．圖13 經(jīng)過不同條件處理的海拉細胞的CLSM圖像

可以直觀地看到，Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX+光照培養(yǎng)組的紅色細胞數(shù)量最多，意味著被殺死的腫瘤細胞最多； 而Cu2-xSe@MIL-100(Fe)+光照和Cu2-xSe+光照組死亡的紅色細胞數(shù)量分別次之，該實驗結(jié)果與上述MTT毒性實驗結(jié)果一致．以上細胞實驗結(jié)果表明所構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX體系可以有效地發(fā)揮光熱、化學(xué)動力學(xué)和藥物治療的三模式協(xié)同治療作用，在腫瘤治療領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景[24-25]。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX復(fù)合材料體系的光熱轉(zhuǎn)換溫度高達50 ℃，可用于光熱治療．經(jīng)轉(zhuǎn)水修飾后在乙醇溶液中一步合成的Cu2-xSe@MIL-100(Fe)核殼材料的比表面積為256.65 m2/g，使得抗癌藥物阿霉素的擔(dān)載率達到40.3%； 體外細胞實驗表明材料的生物相容性較好，材料質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，細胞的存活率高達90%； 材料質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，Cu2-xSe-AIPH+NIR組癌細胞存活率可降至20%．因此，本研究所得Cu2-xSe@MIL-100(Fe)-DOX材料可以有效地發(fā)揮光熱、化學(xué)動力學(xué)和藥物治療的三模式協(xié)同治療作用，在腫瘤治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。