載辛伐他汀PCL-Gt/PCL屏障膜對兔顱骨缺損修復作用的研究

黃崇上，朱慧勇

在臨床中由于各種原因導致的骨缺損十分常見，現有的骨缺損修復治療方法包括自體骨移植、同種異體骨移植以及人工骨替代品移植。引導骨再生技術[1](guided bone regeneration, GBR)是近年來臨床中用于治療骨缺損的主要方法，其中屏障膜的使用能夠選擇性阻斷缺損區域上皮細胞和纖維細胞長入，為成骨細胞增殖，新骨形成提供空間，是治療成功的關鍵因素[2]。然而當下臨床中所使用的屏障膜因缺乏成骨誘導作用，需要協同使用不可吸收的人工骨替代物來促進骨組織再生。因此，尋找既具有良好的屏障功能，又能夠加載生物活性因子并進行緩慢釋放的生物膜成為骨組織工程領域的研究熱點。

靜電紡絲技術能夠通過對噴絲嘴施加高壓，使不同的聚合物溶液形成核殼結構，制備出具有相互連接的三維多孔結構和巨大表面積的生物膜，被用作緩釋系統搭載藥物、生長因子或基因，廣泛應用于生物醫學工程領域[3-4]。我們曾利用靜電紡絲技術成功制備了載有骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)的聚乙二醇/聚己內酯(PEG/PCL)膜，體內和體外實驗證實了該膜能夠促進成骨細胞分化和新骨形成[5]。但是，BMP-2價格昂貴，容易失活，在機體內使用可能引起免疫反應，在臨床應用中受到較大限制。

辛伐他汀是一種脂溶性藥物，能夠通過提高BMP-2的表達來促進體內外成骨[6-7]。在臨床中，辛伐他汀主要通過口服攝入并作用于肝細胞，較難在骨髓中達到有效濃度，調節成骨細胞及破骨細胞的生物學行為。有學者通過皮下注射來達到局部應用辛伐他汀的目的，但需一天多次注射以維持局部濃度，且存在增加炎癥發生的風險，限制了它在臨床中的應用[8-10]。因此，設計并制備能夠加載難溶性辛伐他汀的生物膜，能夠局部緩慢釋放藥物，顯得至關重要。本研究擬通過同軸靜電紡絲技術構建能控釋辛伐他汀的PCL-Gt/PCL膜，評價其穩定性和對骨缺損愈合的影響，為該膜在骨組織工程領域的應用提供理論依據，并為新型骨生物材料的研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取雄性新西蘭大白兔18只(浙江大學動物實驗中心提供)，體重2.0～2.5 kg。隨機分為空白組、陰性對照組和實驗組，每組6只。空白組不植入生物膜，陰性對照組植入PCL-Gt/PCL膜，實驗組植入PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜。本實驗經由浙江大學醫學院附屬第一醫院動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 載辛伐他汀Gt/PCL膜的制備及表征 將明膠(gelatin，Gt)溶解在三氟乙醇(2,2,2-trifluroroethanol，TFE)中，得到質量分數為12%的溶液；辛伐他汀溶解在質量分數為20%的聚己內酯(polycaprolactone，PCL)溶液中，最終質量分數為3.5%。同軸靜電紡絲過程參照已有研究進行[11]。Gt/TFE溶液用于制備外殼；而含有辛伐他汀的PCL/TFE溶液用于制備內核，獲得Gt/PCL-辛伐他汀膜。此后利用單射流將單純PCL膜與Gt/PCL-辛伐他汀膜進行混紡，最終獲得雙層PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜(圖1A)。同時制備不含辛伐他汀的PCL-Gt/PCL膜，所有膜于常溫下避光保存。

使用場發射掃描電子顯微鏡觀察PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜的Gt/PCL-辛伐他汀面及PCL面的表面結構，并測量兩個面的平均孔徑大小(樣本量100)。

1.2.2 辛伐他汀緩釋檢測 將PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜(10 mm× 10 mm)置入離心管中，在37 ℃環境下用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡。每日收集200 μL上清液置于-20 ℃冰箱中保存，并加入200 μL新鮮PBS，持續28 d。使用高效液相色譜儀測定上清液中辛伐他汀的濃度，繪制累積釋放曲線。

1.2.3 骨缺損模型建立 4%戊巴比妥鈉1 mL/kg兔耳緣靜脈注射麻醉。麻醉成功后，顱頂備皮消毒，無菌條件下切開顱骨外側皮膚，暴露顱骨面，于頭部正中額頂交界正中線一側，用牙科低速球鉆，0.9%生理鹽水充分冷卻下制備直徑15 mm洞穿性全厚圓形骨缺損(圖1B)，置入相應膜。陰性對照組及實驗組Gt/PCL面對準缺損區，空白組徹底去除骨膜。軟組織復位，可吸收線分層嚴密縫合。

A：屏障膜大小為20 mm×20 mm；B：于兔顱骨正中制備15 mm圓形缺損

1.2.4 樣本獲取及Micro-CT檢測 手術后4周及12周處死實驗動物獲取樣本，4%多聚甲醛固定24 h后進行Micro-CT掃描，觀察缺損區新生骨情況，檢測骨體積/組織總體積百分比(BV/TV)、新生骨體積(new bone volume)。

1.2.5 HE染色 樣本固定結束后，浸入0.5 mol/L的EDTA溶液中室溫脫鈣4周。經乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，組織切片厚度為4 μm，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察缺損區內新骨形成情況。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 10.0統計軟件進行統計學分析,所得數據以均數±標準差表示,各組間比較采用t檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜表面結構

通過同軸靜電紡絲技術制備的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜具有光滑的納米纖維(圖2)。Gt/PCL-辛伐他汀面為疏松層，交錯纖維所形成的空隙平均最大直徑為(31.71±4.23)μm；PCL面為致密層，空隙間平均最大直徑為(14.05±3.41)μm。

圖2 PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜電鏡圖Fig.2 Electron microscopic view of PCL-GT/PCL-simvastatin membrane

2.2 辛伐他汀緩釋曲線

PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜中辛伐他汀的累積釋放曲線如圖3所示。在前15 d，辛伐他汀的釋放量與時間呈線性關系，25 d后釋放稍趨于平緩，至28 d時仍有辛伐他汀釋放至PBS溶液中。

圖3 辛伐他汀緩釋曲線圖Fig.3 Simvastatin sustained release curve

2.3 Micro-CT檢測

在術后4周及12周，處死對應組別實驗動物并獲取樣本(圖4)。所獲樣本進行Micro-CT掃描，觀察骨缺損區域新骨形成情況(圖5A)。在4周時，三組在骨缺損邊緣均可見少量新生骨組織，在12周時新生骨組織均較4周時增加，PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組術區骨缺損已基本愈合，僅余少量缺損區，顯著優于空白組及PCL-Gt/PCL組。組間t檢驗統計分析結果提示，在4周及12周，無論是新生骨體積及相對骨體積，PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均顯著高于空白組及PCL-Gt/PCL組。

圖4 樣本大體照片Fig.4 General picture of sample

A：空白組、PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組在4周及12周時骨缺損橫截面新生骨形成情況；B：新生骨體積(new bone volume，NBV)；C：相對骨體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)。*：P<0.05

2.4 組織學特點

在4周及12周時獲取標本，進行骨缺損橫截面HE染色。結果如圖6所示，在骨缺損愈合初期(4周)時，空白組骨缺損邊界區仍為大量的纖維結締組織，未見明顯新生骨組織，而PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均可見新生骨島形成，且可見輕微免疫炎癥反應。12周時，三組的纖維結締組織中均可見新生骨形成，未見顯著炎癥反應，且PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組較其余兩組可以觀察到更多的新生骨組織。

在4周時，PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均可見新生骨組織；12周PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組新生骨組織較4周時顯著增多，且其成骨效果優于空白組及PCL-Gt/PCL組；NBI(New bone island)：新生骨島；標尺：400 μm

3 討 論

設計及制備既能夠調控細胞功能，又能促進組織再生的生物膜，是骨缺損再生醫學的關鍵，因此大量生物活性材料及藥物被用于優化生物膜結構來實現骨再生醫學的目標。本研究制備了PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜，代替GBR術中使用的生物膜，結果表明，該膜不僅能防止纖維細胞爬入缺損區，還能穩定釋放辛伐他汀，有效促進缺損區域骨再生。

隨著生物材料的不斷發展，當下對屏障膜的要求已不僅限于屏蔽纖維長入，屏障膜能否為缺損區組織細胞提供合適的生長空間對于骨缺損修復也至關重要。骨缺損區域內的細胞通過跨膜蛋白或整合素相互交流，這些蛋白或整合素作為細胞之間或細胞與細胞外基質之間的連接，允許鈣、細胞因子和前列腺素等信使通過。因此屏障膜的孔隙大小不僅影響細胞的生長，也影響細胞間的物質連接與交換，從而影響骨修復過程[12]。本研究所構建的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜具有三維結構，有利于細胞粘附和遷移的多孔結構。PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜的疏松載藥面孔徑為(31.71±4.23)μm，能夠為骨髓間充質干細胞的附著、增殖和分化提供合適的網絡，致密面孔徑大小為(14.05±3.41)μm，能夠在滲透足夠營養進入缺損區的同時阻止纖維細胞移入，從而更好地誘導骨缺損區域組織再生。

單純的生物膜在常規骨缺損治療中雖然能夠防止纖維長入，加快缺損愈合，在面臨骨極限缺損時，它對骨再生的促進作用仍然有限。骨極限缺損的概念最早由Schmitz等[13]提出，指在特定骨組織上造成的無法自行愈合的最小缺損，兔顱骨極限缺損直徑為15 mm[14]，因此本研究通過體內制備骨極限缺損模型明確機體和PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜之間的相互關系。辛伐他汀主要應用于治療高脂血癥及動脈粥樣硬化等疾病。近年來的研究證實辛伐他汀不僅能夠促進成骨細胞合成BMP-2，還能夠促進骨鈣素、骨橋蛋白及Ⅰ型膠原等成骨標志性因子的表達[15]。無論是全身應用或局部應用辛伐他汀[16-18]，都具有促進成骨細胞分化及新骨形成的作用。我們的結果證實在骨極限缺損條件下，PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜組在術后4周及12周骨缺損區域可見更多的骨組織，表明該膜能夠有效促進缺損區的新骨再生，誘導缺損自然愈合。然而，骨缺損修復不僅需要防止纖維細胞爬入，還需要提供足夠的骨修復空間，本實驗所使用的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜不具備支撐作用，用于臨床中可能出現凹陷，在未來需繼續改進屏障膜特性，從而獲得既具有支撐作用又能夠誘導骨生成的屏障膜。

在骨缺損修復治療過程中，不僅應該明確載藥生物膜在機體骨愈合過程中的作用，是否能進行可控給藥也是非常重要。與生長因子或基因治療相比，在機體局部應用辛伐他汀具有較低的風險。但有學者研究表明，辛伐他汀快速大量釋放，在局部高濃度聚集，有導致炎癥反應的風險，并且緩釋辛伐他汀更加有利于骨髓間充質干細胞的成骨分化[19-20]。因此，需要一種緩慢釋放辛伐他汀的載體，使其在較長時間內發揮作用，同時限制炎癥反應的發生。通過靜電紡絲技術制備的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜，能夠緩慢釋放辛伐他汀。辛伐他汀的累積釋放曲線與膜在PBS中的孵育時間呈線性相關，且所釋放的辛伐他汀仍具有良好的生物活性，能夠在體內長期有效促進新骨形成，表明了PCL-Gt/PCL膜是一種非常穩定的載藥控釋系統。

綜上所述，PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜在體內不僅能夠阻止纖維細胞爬入骨缺損區域，還能夠緩慢釋放辛伐他汀，有效誘導骨愈合過程啟動，促進骨缺損區域新骨形成，為骨組織工程領域提供一種有應用前景的新型骨生物材料。